Что вам нужно знать о гиалуроновой кислоте?

Гиалуроновая кислота, also known as hyaluronan, is a viscous polysaccharide substance formed by the repeated alternation of (1–3) –2–acetamido–2–deoxy–β–D–glucose linked via β–1,4 and β–1,3 glycosidic bonds with (1–4) –O–β–D–glucuronic acid [1]. The molecular weight ranges from tens of thousands to millions. The molar ratio of N-acetylglucosamine to glucuronic acid in the molecule is 1:1, and its structure is shown in Figure 1 [2].

In 1937, Kendell et al. [3] extracted HA from the fermentation broth of a strain of bacteria. Since then, there has been extensive and in-depth research on the distribution, physical and chemical properties, chemical structure, production process, and applications in medicine, cosmetics, and health food.

1 свойства и распределение гиалуроновой кислоты

Hyaluronic acid has many properties in common with other viscous polysaccharides: it is white, an amorphous solid at room temperature, odourless and tasteless, highly hygroscopic, slightly soluble in water and insoluble in organic solvents. However, hyaluronic acid has unique properties compared to other sugars. This is because the glycosidic bonds between glucuronic acid and N-acetylglucosamine on the straight chain axis of hyaluronic acid, hydrogen bonds and interactions with the aqueous solution cause hyaluronic acid to form a rigid helical column with a radius of 200 nm in space. On the one hand, the inner surface of the column is strongly hydrophilic due to the large number of hydroxyl groups; on the other hand, the continuous and directional arrangement of the hydroxyl groups also creates highly hydrophobic areas on the hyaluronic acid molecule chain. It is precisely the hydrophilic and hydrophobic properties of the HA molecule that allow a continuous three-dimensional honeycomb network structure to form even at HA concentrations below 10-3. Water molecules are fixed in the spiral column within this honeycomb network by polar bonds and hydrogen bonds with hyaluronic acid molecules, and are not easily lost. Therefore, hyaluronic acid can absorb about 1000 times its own weight in water like a molecular sponge, and is internationally recognized as the best moisturizer [4].

In nature, HA is widely distributed in various tissues of higher animals. HA has now been isolated from umbilical cords, skin, human serum, chicken combs, synovial fluid, brain cartilage, eye vitreous humor, chicken embryos, human urine, and arterial and venous walls. In mammals, the highest amounts of hyaluronic acid are found in the vitreous body, synovial fluid and umbilical cord [5], while the amount of HA in the comb of a rooster is similar to that in synovial fluid [6]. HA is bound to proteins and coexists with other mucopolysaccharides. It exists in a dissolved form in the vitreous body and synovial fluid, and in a gel form in the comb of a rooster and umbilical cord. Hyaluronic acid is not only found in the tissues of higher animals, but also in some bacteria. Bacteria with high HA content have been found, mainly Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens and Streptococcus hemolyticus types A, B and C [7].

2. Применение гиалуроновой кислоты

2.1 гиалуроновая кислота в косметике

Hyaluronic acid has a good moisturizing effect and is a natural moisturizing ingredient additive in high-end cosmetics. Because it is a natural factor widely present in human skin tissue and has good compatibility, it can be added to almost any beauty cosmetic, from the original creams, lotions, and lotions to the current bath salts, powders, lipsticks, etc. [8]. Its superior performance has attracted widespread attention from the international cosmetics industry. When cosmetics containing HA are applied to the skin surface, hyaluronic acid can form a viscoelastic hydrated film on the skin surface, which can smooth and moisturize the stratum corneum of the skin, and block the invasion of foreign bacteria, dust and ultraviolet rays, protecting the skin from damage. At the same time, hyaluronic acid can penetrate the epidermis of the skin, slightly expand the capillaries, increase blood circulation, improve intermediary metabolism, and promote the absorption of skin nutrients and the discharge of waste. In addition, hyaluronic acid has a strong wrinkle-reducing effect, increases skin elasticity, and delays skin aging. This is the dual effect of hyaluronic acid on skin moisturization and nutrition.

2.2 гиалуроновая кислота в медицине

Hyaluronic acid and its salts are the main components of connective tissue such as the human body's intercellular matrix, the vitreous body of the eye, articular cartilage, and synovial fluid of the joints [9]. Due to its unique physical and chemical properties and physiological functions, hyaluronic acid has been widely used in medicine. In the treatment of joint diseases, supplementing the body with exogenous hyaluronic acid can restore the lubricating function of synovial fluid, creating time for the diseased joint to repair itself, promote joint repair and functional improvement; in ophthalmic surgery, it can effectively support the anterior chamber after being injected into the anterior chamber, and can form a protective film on the surface of other tissues in the eye and the surface of surgical equipment to prevent mechanical damage to the equipment; in surgical operations, hyaluronic acid can be used to prevent postoperative adhesion and promote skin wound healing; as a medium, HA is also widely used in eye drops [10]. In addition, hyaluronic acid can be combined with other drugs to achieve targeted and timed release by using the targeting effect of HA receptors. Therefore, with the gradual development of medical technology, the application of hyaluronic acid in the medical field will become more and more extensive.

2.3 применение гиалуроновой кислоты в пищевой промышленности

The amount of hyaluronic acid in the human body is about 18g, and it plays a vital role in the physiological activities of the human body. If the Содержание гиалуроновой кислоты in the joint cavity, blood vessels, heart, eyes, brain and other tissues and organs decreases, it may lead to diseases such as arthritis, atherosclerosis, pulse disorders and brain atrophy. Oral intake of hyaluronic acid can supplement the body's отсутствие га и предотвратить старение тканей и клеток, вызванное отсутствием гиалуроновой кислоты в организме. В частности, она оказывает значительное воздействие на поддержание здоровья пожилых людей. Гиалуроновая кислота может задерживать старение через пищеварение и всасывание, оставляя кожу увлажненной, гладкой, мягкой и эластичной [11]; В то же время, оральная гиалуроновая кислота может также сделать людей полными энергии и молодости жизненной силы. В настоящее время все больше внимания уделяется и принимается все большим числом людей пероральной гиалуроновой кислотной пище для красоты и здоровья.

3 подготовка гиалуроновой кислоты

Есть два основныхmethods for preparing hyaluronic acidПервое — извлечь его из тканей животных, а второе — получить через микробную ферментацию [12].

3.1 метод экстракции тканей

HA is widely found in the interstitial matrix of various animal tissues, such as skin, joint synovial fluid, cartilage, eye vitreous body, rooster comb, chicken embryo, etc. Among them, the human umbilical cord, rooster comb, joint synovial fluid and eye vitreous body have the highest hyaluronic acid content. The general method for extracting HA from tissues is as follows: animal tissue is first homogenized, then dissolved in water and a dilute salt solution. The solution is precipitated with hexadecylpyridinium chloride, and the resulting precipitate is dissolved in sodium chloride solution. The crude product is then precipitated with a threefold ethanol solution, and purified repeatedly using hexadecylpyridinium chloride and ethanol, or by gel and ion exchange chromatography. The hyaluronic acid obtained from humans and animals has a higher viscosity and better moisturizing properties, and its relative molecular weight is generally greater than 600,000. At present, most of the hyaluronic acid used in high-end cosmetics and medical-grade ophthalmology is still obtained by this method. However, the traditional extraction method is costly, the source is limited, and the purification is complicated, making it difficult to meet the ever-increasing demand [13].

3.2 метод ферментации

Since the 1970s, some people have been using microbial fermentation to produce hyaluronic acid. In 1985, Shiseido of Japan first reported the use of Streptococcus zooepidemicus to produce hyaluronic acid. The commonly reported hyaluronic acid-producing bacteria are mainly Group A and Group C streptococci in the Berger's руководство. Группа а включает главным образом пёгенные стрептококчи и т.д., которые являются патогенами человека и не должны использоваться в качестве производственных штаммов; Группа C стрептококчи являются нечеловеческими патогенами и более пригодны для промышленного производства. В настоящее время промышленное производство гиалуроновой кислоты с использованием стрептококковых пёгенов в последние годы уже достигло промышленной стадии. Как правило, урожайность и качество гиалуроновой кислоты, получаемой с помощью микробных методов, зависят главным образом от следующих аспектов: производительность производственного штамма, оптимизация культурной среды и процесса ферментации, контроль за процессом ферментации, а также последующее разделение и очистка ферментации.

3.2.1 отбор и селекция высокоурожайных штаммов

The breeding of high-yielding hyaluronic acid strains is a very important task that must be carried out over the long term. At present, China'. Селекция гиалуроновых кислотных штаммов по-прежнему в основном основана на традиционном искусственном мутагенезе. Общий метод мутагенеза заключается в следующем: получить первоначальный штамм от природы или животного, определить его как Streptococcus zooepidemicus и произвести гиалуроновую кислоту, а затем использовать этот штамм в качестве исходного штамма для NTG, ультрафиолетового излучения или комбинации этих двух. Штамм, который является генетически стабильным и производит высокие уровни гиалуроновой кислоты, выбран в качестве исходного штамма для продолжения мутагенеза. Этот процесс повторяется много раз, чтобы увеличить уровень производства гиалуроновой кислоты. Тем не менее, с постоянным углубленным изучением механизма стрептококкового зоэпидемика, производящего гиалуроновую кислоту, клонирование ключевых ферментов для биосинтеза га и создание генетически модифицированных бактерий для увеличения производства га и контроля его молекулярного веса стали предметом текущих исследований и разработок.

3.2.2 соответствие среды культуры

The requirements of Streptococcus zooepidemicus for the production of hyaluronic acid are extremely demanding. Currently, the main carbon source for industrial production of hyaluronic acid is glucose, and the nitrogen source is yeast powder, peptone, beef extract or compound organic nitrogen source. However, when the medium is not properly matched, resulting in an imbalance in the ratio of nitrogen and carbon sources or a lack of growth factors, the metabolic pathway of Streptococcus zooepidemicus will change, and more of the substrate glucose will be converted into by-products such as lactic acid or acetic acid, affecting the fermentation production level of hyaluronic acid. Therefore, the choice of culture medium is extremely important.

3.2.3 оптимизация технологии ферментации и управление процессом ферментации

Streptococcus zooepidemicus, which produces hyaluronic acid, is a facultative anaerobe, and hyaluronic acid is the main component of the capsule of Streptococcus zooepidemicus. When there is too much dissolved oxygen in the fermentation broth, it will cause damage to the bacteria. Insufficient dissolved oxygen will result in a lack of stimulation of Streptococcus zooepidemicus, which will lead to the bacteria not producing capsules and reduce the production of hyaluronic acid. The main process factors affecting the dissolved oxygen level in the fermentation broth are the rotational speed and the amount of aeration. In addition, different temperatures, rotational speeds and pH values have a significant effect on the molecular weight of hyaluronic acid. Studying the fermentation kinetics of hyaluronic acid can help us understand the laws of the fermentation production process, so that we can optimize and control the fermentation process to improve the production level and efficiency of hyaluronic acid.

3.2.4 отделение и очистка гиалуроновой кислоты в броте ферментации

The downstream separation and purification process is a key link in obtaining high molecular weight and high purity hyaluronic acid, and it is the bottleneck restricting the production of high-standard HA in many companies. The hyaluronic acid fermentation broth is very viscous and is a complex multi-phase system. The fluid properties are non-Newtonian. The main suspended solids in the fermentation broth are: fermentation product hyaluronic acid, bacterial cells, various impurity proteins and residual components in the culture medium and other metabolites. It is difficult to quickly and effectively separate HA from other components in the fermentation broth. At the same time, autolysis of the bacteria in the fermentation broth can produce hyaluronidase to degrade HA, which greatly reduces the molecular weight of HA [14]. Therefore, finding a suitable separation and purification process is of great significance for the preparation of high-standard hyaluronic acid.

Перспективы на будущее

Fermentation is a cost-effective method for producing hyaluronic acid, and the extraction process is simple. It has been scaled up for production and has broad market prospects. The international market price for cosmetic-grade HA is 1000 to 2000 $/kg, while the price for pharmaceutical-grade HA is 6000 to 20000 $/ кг. В 1985 году общий объем продаж га на международном рынке составил 100 млн. долл. США, в 1990 году-более 200 млн. долл. США, а в 1995 году - 600 млн. долл. США. Статистика показывает, что глобальный рынок продуктов, связанных с гиалуроническими кислотами, в 2004 году составлял около 3 млрд. долл. США, причем на фармацевтические и косметические добавки для ухода за кожей и медицинские продукты приходилось по половине рынка. Европа, США и Япония являются крупнейшими рынками для производства и использования гиалуроновой кислоты, и ожидается, что в будущем они будут расти на 15% в год. В настоящее время ежегодный внутренний спрос на гиалуроновую кислоту составляет около 5 тонн.

Since the 1980s, the production of hyaluronic acid by fermentation has been achieved abroad, and the number of manufacturers has increased from more than ten to hundreds, and the scale is also getting larger and larger. In contrast, in China, the production level and production efficiency of hyaluronic acid are relatively low, and there are few manufacturers that produce HA by microbial fermentation, which seriously restricts the development and application of hyaluronic acid in China. At present, the main bottlenecks in the development of hyaluronic acid production in China and the problems that need to be solved are mainly the following:

(1) я Низкая урожайность бактериальных штаммов: согласно китайской литературе, урожайность на лабораторном уровне может достигать примерно 6-8 г/л, но после применения в промышленности, урожайность может быть гораздо ниже из-за таких факторов, как сырье и условия ферментации. По-прежнему существует большой разрыв между международным уровнем ферментации предприятий от 8 до 10 г/л и более. Поэтому использование традиционных методов мутагенеза или генной инженерии для получения высокоурожайных штаммов бактерий является важным направлением исследований для применения.

(2) Small and uneven molecules: There are many factors that affect the molecular size of hyaluronic acid. According to literature reports, during the fermentation process, dissolved oxygen, pH, and temperature can all affect the molecular size.

(3) незрелый процесс ферментации: кинетика является основой для применения современной технологии ферментации. Его изучение может помочь нам понять законы процесса ферментации, так что производственный процесс можно оптимизировать и контролировать для получения высоких коэффициентов преобразования субстратов и высокой интенсивности производства.

(4) The fermentation mechanism is not clear: According to existing literature reports, only a very small number of substrates can be converted into hyaluronic acid. Although the research on the synthesis pathway of hyaluronic acid has been carried out at the molecular level, there is no feasible and effective theory that can greatly increase the yield of hyaluronic acid.

Справочные материалы:

[1] линг пейкшу. Кислота гиалуроновая [м]. Пекин: China Light Industry Press, 2000.

[2] лоран т. биохимия гиалуроника. Acta Otolaryngol (Stockh) [J], suppl, 1987(442):7-24.

[3] кенделл ф е, хайделлбергер м, доусон м. J Biol Chem, 1997 (118): 61-69.

[4] у донгру. Биохимия углеводов [м]. — Пекин: издательство «высшее образование», 2001.

[5] погрел м а, лоу м а, стерн р. гиалуроновая кислота в слюне человека [J]. Айч орал биол, 1996, 41: 667 — 671.

[6] ван донг. Синтетическая гиалуроновая кислота в японии [J]. Журнал химической промышленности и машиностроения, 2002(1): 16

[7] чжан хучжун, вен юанлин. Химия животных активных ингредиентов [м], тяньцзинь: Tianjin Science and Technology Publishing House, 1995.

[8] сюй хон, Лу чжихуа. Применение гиалуроната натрия в косметике [J]. Китайский журнал биохимических препаратов, 1998: (5): 222-223.

[9] вентилятор. Влияние гиалуроновой кислоты на содержание цитокинов в синовиальной жидкости остеоартрита колена [D]. Циндао: циндао университет, 2005.

[10] би ин. Исследование гиалуронатной пленки натрия для предотвращения адгезии после операции [D]. Циндао: циндао университет, 2002.

[11] янь сужен, чэнь гируи. Характеристики гиалуроновой кислоты и ее применение в пище [J]. Наука и технологии пищевой промышленности, 2008, 29(6): 317 — 320.

[12] исикава, осаму. Nippon Gankaishi [J]. Ганка, 1987 (38): 927.

[13] Лу, нианчи, тан тяньвэй. Подготовка и применение гиалуроновой кислоты [J]. Журнал функциональных полимерных наук, 2001, 14(3): 370-376.

[14] Kui Miaomiao, Cui Bo, Sun Hongbo и др. Прогресс в исследовании методов добычи и определения содержания зеленого лукового масла [J]. Журнал шаньдунского университета легкой промышленности, 2010, 24(3): 1-3.