Что такое биосинтез ванилина?

Ванилин является основным компонентом ванили, также известный как ванилин, ванилин, ванилин альдегид и т.д. Химическое название 4- гидрокси -3- метоксибензальдегид (4- гидрокси -3- метоксибензальдегид), относительная молекулярная масса 152.15, порошковый кристаллический порошок или кристалл иглы от белого до светло-желтого. Ванилин существует в растении в свободной форме и в виде глюкозидов, составляя от 2% до 3% сухого веса ванильной фасоли. Чистый ванилин имеет сильный молочный аромат и никакого запаха. Ванилин имеет широкий спектр применения, в дополнение к использованию в качестве парфюмерно-ароматического агента, он также является важным сырьем и промежуточным в фармацевтической промышленности, а также может быть использован в качестве гальванического покрытия польского, стимулятор роста растений, созревающий агент и так далее.

Ванилин является крупнейшей синтетической специей в мире, с годовым потреблением около 12000 тонн, и его спрос по-прежнему растет на 10% в год. Производство природного ванилина, добываемого и получаемого из ванили, является низким, всего около 20~50 т в год, а остающийся разрыв в потреблении заполняется методом химического синтеза, который имеет много неизбежных недостатков, таких как однократный аромат, легко фальсифицируется и т.д., но люди и#39. Спрос на природный ванилин постоянно растет.

Спрос на природный ванилин постоянно растет. Поскольку выращивание ванили ограничено климатическими и географическими условиями, а обработка ее аромата является сложной, производство ванилина трудно удовлетворить рыночный спрос. Биологические методы могут синтезировать природный ванилин [1] и обладают преимуществами меньшего загрязнения, более чистого производства и безопасности. В настоящее время сообщаемые биологические методы включают микробную ферментацию, культуру растительных клеток и метод фермента.

1 микробная ферментация

В 1977 году тадаса к изолировал штамм коринебактерий sp., который мог преобразовать эугенол в ванилин [2], что открыло новый способ биологически подготовить ванилин. Впоследствии было установлено, что многие бактерии и формы способны преобразовывать эугенол, изоэгенол, феруловую кислоту, глюкозу и другие соединения в ванилин, и ванилин может синтезироваться путем микробной ферментации с использованием различных субструатов.

1. Работа. 1 Eugenol или Isoeugenol в качестве субстрата

Эугенол и его изомер изоугенол, полученные главным образом из летучего масла клей базиля лабиатов, химическое название эугенола 4- пропенил -2- метоксифенол [2- метакси -4-(2- пропенил)- фенол], а химическое название изоугенола -4- пропенил -2- метоксифенол [2- метакси -4-(1- пропенил)- фенол]. Химическое название изоэгенола 4- пропенил -2- метоксифенол [2- метакси -4-(1- пропенил)- фенол], оба из которых могут быть химически или биологически преобразованы в ванилин. В дополнение к Corynebacterium sp., Serratia sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., и некоторые грибы в классе Hemiptera также способны преобразовать эугенол в ванилин [3, 4]. Кроме того, марши Serratia, Klebsiella marcescens и Enterobacter marcescens могут превратить изюженол в ванилин. Bacillus subtilis и Rhodococcus subtilis также способны преобразовать изоэгенол в ванилин.

Родохоз также обладает способностью преобразовывать изжогенол в ванилин [5, 6].

Преобразование эугенола в ванилин грибковыми штаммами класса Hemiptera не дало высоких урожаев с максимальным содержанием 0,0271 г/л [4]. Штамм Bacillus subtilis B2 может использовать изоэгенол в качестве единственного источника углерода и конвертировать его в ванилин с мощностью 0,61 г/л и молярной мощностью (с точки зрения изоэгенола) 12,4% [5]; Когда б. Purpurea MTCC 289 штамм использует изоэгенол в качестве основы, при оптимальных условиях культуры в лаборатории, молярная урожайность ванилина (с точки зрения изоэгенола) может достигать 58% [6].

Хотя штамм Serratia marcescens DSM 30126 также использовался, результаты сильно варьировались в зависимости от субстрата [3]. Молярная урожайность ванилина (с точки зрения эугенола) составила лишь 0,1% при урожайности 0,018 г/л, в то время как урожайность ванилина (с точки зрения изоугенола) составила 20,5% при урожайности 3,8 г/л. В отличие от этого, урожайность ванилина, получаемая с использованием изоэгенола в качестве субстрата, составляла 20,5%, а урожайность ванилина, получаемая с использованием изоэгенола в качестве субстрата, - 20,5%. В отличие от этого, урожайность ваниллина, полученного с помощью изоэгенола в качестве субстрата, была выше, чем у эугенола в качестве субстрата, что также было результатом авторства &#- 39; Ферментация со штаммом Serratia marcescens AB 90027. Изоэгенол является более подходящим субстратом, чем эугенол, для производства ванилина путем микробной ферментации.

1. Работа. 2 феруловые кислоты В качестве субстрата

Феруловая кислота, химически известная как 4- гидрокси -3- метоксикоричная кислота, широко распространена в побочных продуктах сельского хозяйства, таких как кукурузное глютен и зерновые отрубцы. Существует два способа получения ванилина путем ферментации с использованием феруловой кислоты в качестве субстрата: Один требует действия одной бактерии, в то время как другой требует комбинированного действия нескольких штаммов бактерий.

Сообщается о единичных штаммах грибов, используемых для производства ванилина путем ферментации [4, 7, 8], включая некоторые грибы ордена Bacillus coagulans и почвенные филяментальные грибы (Amycolatopsis sP.). Только 0,0552 г/л ванилина было получено с помощью грибкового штамма ордена Hemiptera [4]. В отличие от этого ванилин производился из 4- винилгуаяколя штаммом Bacillus coagulans BK 07, который использует феруловую кислоту в качестве единственного источника углерода. Этот штамм может метаболизировать более 95% феруловой кислоты в течение 7 часов, и основным продуктом является 4- винилгуайаколь, который является самым быстрым процессом метаболизма феруловой кислоты, о котором сообщалось до сих пор [7]. В запатентованном методе, изобретенном Rabenhorst J et al. [8], почвенная филяментная бактерия DSM 9992 штамм была использована для преобразования феруловой кислоты в ванилин с урожайностью 11,5 г/л. О механизме этого процесса пока не сообщается.

"Двухэтапный метод биопреобразования" Предложение Lesage-Meessen L et al [1] является типичным примером производства ванилина в результате комбинированного действия нескольких штаммов, которые используют Aspergillus Нигер и pycnoporus cinnabarinus для завершения всего процесса преобразования. Этот метод использует сочетание аспергилла Нигер и Pycnoporus cinnabarinus. Во-первых, аспергилл Нигер преобразовал феруловую кислоту в ванильную кислоту с доходностью 0,92 г/л и молярной доходностью 88% с точки зрения феруловой кислоты, а затем понизил ванильную кислоту до ваниллина с доходностью 0,237 г/л и молярной доходностью 22% с точки зрения ванильной кислоты пинопоросом синнабарином. Недавно они [9] заменили феруловую кислоту на кукурузные отрубки в качестве единственного источника углерода и создали «двухэтапный метод биопреобразования» Для получения кристаллов ванилина без каких-либо очистных мер.

Согласно исследованию [10, 11], при уменьшении ванильной кислоты до ваниллина м. вертициллиоидными, выход ваниллина будет снижена за счет образования побочного продукта метоксигидрохинона; Когда массовая концентрация ванилина в среде превышает 1,0 г/л, он будет очень токсичен для м. вертициллиоидов, что замедлит рост м. вертициллиоидов, и в то же время значительное распространение этого штамма не способствует производству ваниллина. Добавление цельбиозы в эту систему значительно сократило производство гидроксиметоксихинона и увеличило урожайность ванилина в 3,3 раза до 0,725 г/л. Добавление соответствующего количества адсорбированного ванилина XAD-2 могло бы регулировать массовую концентрацию ванилина в среде и темпы роста штамма, а использование механически перемещаемого биореактора могло бы значительно улучшить эффект переноса массы, а урожайность ванилина могла бы достичь 1,575 г/л. Результаты показали, что производство ванилина в этой системе не было благоприятным для производства ванилина, и это может быть использовано в производстве ванилина.

1. Работа. 3 глюкозы в качестве субстрата

Глюкозу можно получить путем гидролиза крахмала, который является достаточным сырьем с низкой стоимостью, но есть только Один случай биотрансформации глюкозы в качестве субстрата для производства ванилина [12]. Во-первых, глюкоза была преобразована в ванильную кислоту рекомбинантами Escherichia coli (Escherichia coli KL7/PKL5). 26A или KL7/PKL5. 97A, а затем ванильная кислота была уменьшена ароматической альдегидной дегидрогеназой, изолированной от Neurospora crassa, чтобы производить ванилин. Для того, чтобы сделать метод биоконверсии глюкозы-субстрата промышленно применимой технологией для производства природного ванилина, необходимо решить проблему стабильного выражения рекомбинантов в кишечной палочке.

Короче говоря, несмотря на то, что глюкоза недорогая, как реализовать стабильное выражение рекомбинантов кишечной палочки является ключом к практическому применению; С точки зрения сырьевых ресурсов и нынешнего состояния биотехнологии в китае биоконверсия изоэугенола и феруловой кислоты в качестве субструата для производства ванилина имеет более многообещающие перспективы развития.

2 метод культуры растительных клеток

Развитие современной биоинженерии привело к идее и практике использования клеточной культуры для производства ванилина. Первым из них была искусственная культура ванильных клеток планолии, которая использовала свойствами экзоцитоза ванилина клетками, но урожайность на единицу объема не была высокой, всего около 0,01 г/л [13]. В последнее время были найдены новые методы преобразования конкретных добавок в ванилин, такие как capsicum 'rutescens cells&#- 39; [14-16].

Эти клеточные культуры и их производство ванилина зависят от таких факторов, как добавки и условия роста клеток [17]. Cao Mengde et al. [13] пришли к выводу о Том, что добавление различных типов и концентраций фитогормонов не оказывает значительного воздействия на рост клеток, но оказывает значительное воздействие на производство ванилина, а сочетание нафталенуксусной кислоты и 6- бензоладенина приводит к образованию большего количества ванилина. Образование ванилина негативно коррелируется с ростом клеток, то есть медленный рост клеток способствует формированию целевого продукта, поэтому для выращивания ванилиновых клеток и производства ванилина может быть рассмотрен двухэтапный метод культуры [18].

В дополнение к растительным клеткам, производящими ваниль, в культуре подвески имеются также клетки кустарного перца и кровельные клетки Haematococcus pluoialis, которые могут преобразовывать добавки в ванилин [14-16]. Из-за недостатков культуры подвешенности клеток, таких как нефиксированное положение клеток, неблагоприятная организация клеток и трудности контроля за условиями культуры, урожайность целевого продукта ванилин не является высокой, что может быть улучшено клеточной культуры иммобилизации, так что урожайность ванилина может быть увеличена.

Как отмечалось выше, клетки кустарного Чили могут преобразовывать некоторые специфические добавки, такие как изоэгенол, протокатечуиновый альдегид и кофеиновая кислота, в ванилин. В таблице 1 показано максимальное производство ванилина и его наличие по отношению к добавкам при иммобилизации кустарниковых клеток Чили [14, 15].

Можно видеть, что изоэгенол является лучшим из трех добавок, и это более эффективно, если β-cyclodextrin добавляется для улучшения растворимости изоэгенола и снижения его токсичности для клеток, или если аспергиллиус Нигер мицелий добавляется в качестве индусора. Подобно клеткам кустарного перца, R. rainbowii клетки также могут преобразовывать феруловую кислоту или турпентин в ванилин [16]. Максимальная урожайность ванилина составила 0,0106 г/л с добавлением феруловой кислоты (при концентрации 1,0 ммоль/л) и 0,0205 г/л с добавлением альдегида-турпентина (при концентрации 1,0 ммоль/л) в процессе отверждения. В заключение следует отметить, что эффективность существующих культур растительных клеток для производства ванилина невысока и все еще далека от индустриализации.

3. Ферзиматика

Все биометаболические реакции являются ферзиматическими, и, хотя механизм действия различных описанных выше методов еще не ясен, можно определить, что они производятся действием одного или нескольких ферментов. Если эти ферменты могут быть изолированы и использованы в ферментативных реакциях, ванилин может быть произведено более непосредственно.

Van den Heuvel Robert H H et al. [19] из вагенингенского университета, Нидерланды, пришли к выводу о Том, что ванилин может быть получен с помощью оксидазы ванильного спирта (VAO) двумя способами. Одним из них является производство ванилина из древесного смоляного спирта через ванильный спирт в присутствии VAO. В другом случае ваниллиламин преобразуется вао в щелочных условиях в промежуточный продукт, который может быть непосредственно гидролизирован в ванилин. Поскольку красный перец и капсаицин могут быть ферзиматически деградированы для производства ванилина, последний маршрут обеспечивает более богатый источник сырья и делает его более конкурентоспособным. Патент [20] сообщил, что фермент по имени ширазим л 20] сообщается, что липаза под названием chirazyme L-2, c-f, c2 lyo смогла преобразовать изоэгенол и сосновый алдегид в ванилин с массовыми долями 30,4% и 83,1%, соответственно, и что эта липаза также может быть изолирована от Candida антарктики.

В силу преимуществ высокой эффективности, специализации, мягких реакционных условий, легкой очистки продуктов, низкого потребления энергии, низкого уровня загрязнения, простоты эксплуатации и контроля цифровая реакция должна иметь несопоставимое превосходство. Тем не менее, как использовать теорию фермента, химическую инженерию и современную биотехнологию для изменения существующих ферментов, изучить их иммобилизационную технологию и разработать подходящий многоферментный реактор будет главной задачей для производства ванилина ферментным методом.

4. Выводы

Все больше внимания уделяется производству ванилина биологическими методами, и многие известные компании-производители ванилина в мире, такие как шникен (Италия), бореай (Норвегия) и монсанто (США), активизировали исследования по производству ванилина биологическими методами, с тем чтобы занять доминирующее положение на рынке специй в будущем. Китай по-прежнему находится на начальной стадии в этом отношении, в настоящее время существуют только исследования цао мендэ из хуазхонского университета науки и техники по культуре подвески ванильных клеток, и исследования яо ришэн из хефейского технологического университета по производству ванилина методом биоокисления в сотрудничестве с Xiamen Yongquan Group Company Limited.

Поэтому необходимо использовать сочетание методов производства, обучения, исследований и государственного финансирования, а также активизировать исследования сотрудничества, с тем чтобы наша страна заняла место на рынке биосинтезированного ванилина. Поэтому необходимо активизировать совместные исследования с помощью сочетания промышленности, научных кругов, научных исследований и государственного финансирования, с тем чтобы Китай мог занять место на рынке биосинтетических ванилей.

Хотя в исследованиях по нехимическому синтезу ванилина достигнут значительный прогресс, для реализации промышленного производства все еще необходимо решить следующие проблемы: получение превосходных инженерных штаммов; Совершенствование технологии культуры растительных клеток; Исследования по технологии изоляции, очистки и иммобилизации ферментов, а также разработки многоферментных реакторов. Согласно современному состоянию искусства, себестоимость производства ванилина растительными клетками составит 15 000 долларов США/кг, а себестоимость извлечения ванилина из ванильной фасоли традиционными методами — 4 000 долларов США/кг, а стоимость использования микробной ферментации — около 1 000 долларов США/кг [17]. Поэтому исследования и разработки микробной ферментации ванилина с использованием изоэугенола и феруловой кислоты в качестве субструтов будут более перспективными для производства ванилина в китае.

Справочные материалы:

Лесаж-мессен л, делаттер м, хаон м и др. Двухэтапный процесс биопреобразования для производства ванилина из феруловой кислоты, сочетающий аспергилл Нигер и пинофор синнабарин [J]. И pycnoporus cinnabarinus [J]. J биотехнол, 1996, 50:107-113.

[2] тадаса к. разложение эугенола микроорганизмом [J]. Agric Biol chem, 1977, 41(6):925 — 929.

[3] Rabenhorst J, Hopp R. процесс приготовления ванилина [p]. США: 5 017 388, 1991-05-21.

[4] Bavutti Hamilton R F, Anazawa Tania A, Durrant Lucia R. исследование ванильного синтеза штаммами грибов дейтеромикета [J]. Braz symp chem Lingins Other wood compon, 1997, 6: 605-611.

[5] shimoni E, Ravid U, shoham Y. изоляция Bacillus sp. J биотехнол, 2000, 78 (1): 1 — 9.

[6] chatterjee T, De B K, bhatacharyya D K. микробное преобразование изжогенола в ванилин родококковой родохромой [J]. Индийский джем, 1999, 38B(5):538-541.

[7] кармакар б, вохра р м, нанданвар х и др. Быстрое разложение феруловой кислоты через 4- винилгуаяколь и ванилин новым изолированным штаммом Bacillus coagulans[J]. J биотехнол, 2000, 80: 195 — 202.

[8] Rabenhorst J, Hopp R. процесс приготовления ваниллина и микроорганизмов, подходящих для него [p]. США: 6 133 003, 2000 I 10 I 17. [9] Lesage-Meessen L, Lomascolo A, Bonnin E, et al. Биотехнологический процесс с использованием филятивных грибов для получения природного кристаллического ванилина из кукурузного отрубья [J]. Биотехнологический процесс с использованием филятивных грибов для получения природного кристаллического ванилина из кукурузного отрубья [J].  Appl Biochem Biotech, 2002, 102/103:141 i 153.

[10] Bonnin E, Grang6 H, Lesage-Meessen L, et al. Энзимическое высвобождение цельбиозы из сахарной свеклы целлюлозы и ее использование для содействия производству ванилина в пирофоре синнабарине из ванильной кислоты [J]. Карбогидр полим, 2000, 41:143 i 151.

[11] stentelaire C, Lesage-Meessen L, Oddou J, et al. Разработка грибкового биопроцесса для производства ванилина из ванильной кислоты на масштабируемом уровне pycnoporus cinnabarinus[J]. J Biosci Bioeng, 2000, 89(3):223 i 230.

[12] Li K, Frost J W. синтез ванилина из глюкозы [J]. J Am Chem soc, 1998, 120:10545 I 10546.

[13] цао мендэ, цинь дунчунь, чэнь цикай и др. Исследование по вопросу о производстве ванилина методом подвески ванильных планифолиевых клеток [J]. Журнал Huazhong University of Science and Technology, 1998, 26(5):8-10.

[14] рамачандра рао с, равишанкар г. а. биотрансформация изоэгенола в метаболиты ванильного вкуса и капсаицин в клещевых культурах capsicum ' рутессины: изучение влияния колючек и грибков elicitor [J]. Proc Biochem, 1999, 35:341 i 348.

[15] рамачандра рао с, равишанкар г. а. биотрансформация протокатехических альдегидов и кофеиновой кислоты в ваниллин и капсаицин в свободно взвешенных и иммобилизированных клеточных культурах капсикума «рутесенов» [J]. J биотехнол, 2000, 76: 137 i 146.

[16] Tripathi U, Ramachandra Rao s, Ravishankar G A. биотрансформация фенилпропаноидных соединений в метаболиты ванильного вкуса в культурах Haematococcus pluvialis [J]. Raishankar G A. биотрансформация фенилпропаноидных соединений в метаболиты ванильного вкуса в культурах Haematococcus pluvialis [J].

[17] сон ган, као джинсон, пэн чжиинг. Биосинтез ванилина [J]. Пищевая промышленность и ферментация, 2001, 27(7):72-74.

[18] цао менгде, ли цзяру, цинь дунчунь и др. Влияние адсорбентов и среднего состава на производство ванилина в культуре суспензии ванильных планифолиевых клеток [J]. Ботанические исследования, 2002, 22(1):65-67.

[19] van den Heuvel Robert H H, Fraaije Marco W, Laane C, et al. Энзиматический синтез ванилина [J]. J Agric Food Chem, 2001, 49(6):2954 i 2958.

[20] гэтфилд I-L, хильмер J-M. Процесс подготовки ароматических карбониловых соединений из стиренов [п]. США: 6 331 655, 2001 I 12 I 18.