Исследование метода производства ликопенового порошка

Ликопен является важным каротеноидомОтносится к семейству тетратерпеноидов terpene- да. Встречается в природе главным образом в помидорах, помидорах и фруктах, таких как арбузы и грейпфруты. Это основной пигмент в спелых помидорах. Ликопен является сильным антиоксидантом с физиологическими функциями, такими как антиокисление, антирак и снижение липидов крови. Широко используется в пищевой промышленности, медицине, косметике и других областях [1-2]. В настоящее время ликопен широко используется в качестве питательной добавки и красителя во многих странах [3]. Совокупный объем продаж ликопенового сырья в мире растет из года в год, и перспективы рынка широки.

Производство ликопенового порошкаВ основном опирается на два метода: экстракция растений и химический синтез. Метод экстракции растений ограничен сезонностью, а длительный цикл роста растений и низкое содержание продукции не могут обеспечить интенсивное и масштабное производство продукции. Метод химического синтеза сопряжен с такими проблемами, как остатки химических реагентов, множественные изомерные формы и загрязнение окружающей среды. Метод синтеза биотехнологии имеет такие преимущества, как низкая стоимость, короткий цикл, стабильное предложение и экологически безопасное и устойчивое развитие. В последние годы она привлекает все больше внимания исследователей.

В настоящее время проводятся исследованияБиотехнологический синтез ликопенового порошкаДостигнут значительный прогресс в таких областях, как диверсификация выбора клеток микробных хостов, исследования и инновации в метаболической инженерии для преобразования путей, а также изучение процессов ферментации и усиления, что значительно повысило урожайность ликопена, синтезированного биотехнологией. Однако большинство исследований по-прежнему сосредоточено на достижениях в одной технической области, и относительно мало систематических исследований и резюме биотехнологического синтеза ликопена.

Поэтому в настоящем документе рассматриваются физические иХимические свойства ликопена и современные технологии производства, систематически обобщает результаты исследований биосинтеза ликопена с использованием биотехнологии синтетической биологии, уделяя особое внимание сопоставлению методов ферментации различных штаммов и точных методов количественной оценки ликопена, а также предлагает проблемы производства ликопена с использованием биотехнологии и будущие направления исследований, С целью обеспечения основы для промышленного производства ликопена с использованием биотехнологии и биосинтеза других натуральных продуктов с высокой добавленной стоимостью с использованием биотехнологии.

1. Физические и химические свойства и применение ликопенового порошка

Ликопен-это тетратерпеновое соединение.Ненасыщенный алкенил соединение, и каротеноид, который не содержит атомов кислорода. Ликопен имеет молекулярную формулу C40H56 и относительную молекулярную массу 536,85. В молекулярной структуре он имеет 11 конъюгированных двойных связей и 2 неконъюгированных двойных связей и часто существует в изомерах СНГ-транс. В природе, природный ликопен в основном все-транс, с очень небольшим количеством СНГ.

Ликопен порошок жирорастворимый пигмент, который нерастворим в воде,Но растворимы в липидах и неполярных органических растворителях. Его молекулярная структура состоит из хромофора, который соответствует уникальной области поглощения в ультрафиолетовом спектре поглощения. Глубина цвета варьируется от оранжево-желтого до темно-красного в зависимости от концентрации ликопена и может незначительно меняться с растворителем. Например, кристаллы ликопена, растворенные в подсолнечном масле, кажутся видимыми темно-красными, а растворенные в нефтяном эфире — желтыми. Из-за относительно большого количества двойных связей в молекуле ликопель очень реактивна и подвержена окислению и структурной изомеризации в условиях света, кислорода и высоких температур, что может привести к снижению физиологической активности [4]. Поэтому при добыче ликопена часто добавляются антиоксиданты, такие как витамин с, витамин е, 2,6- ди-трет-бутил -4- метилфенол (BHT) и трет-бутилгидрохинон (TBHQ) [5].

В отличие от другихУ-каротин, ликопенНе обладает проактивными свойствами витамина а, поэтому его применение не оценивалось в первые дни. Однако в последние годы по мере того, как физиологические функции ликопена постепенно становятся все более известными, его применение становится все более распространенным. Ликопен является мощным антиоксидантом, который может собирать свободные от кислорода радикалы в организме человека и погашать синглет кислорода. Его антиоксидантная способность примерно в 100 раз больше витамина е и в два раза больше бета-каротина [6-9]. Также доказано, что она имеет противоопухолевые, предотвращает заболевания предстательной железы и снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний [10-11]. Широко используется в косметике, медицинских и пищевых продуктах. В настоящее время ликопен получил одобрение европейского союза и статус "общепризнанной безопасной" (GRAS) в соединенных штатах. С улучшением людей#39; уровень жизни и растущее внимание к здоровью, Соединенные Штаты прогнозируют, что продажи ликопена будут расти на 35% в год. Таким образом, эффективная технология биосинтеза ликопена имеет большую рыночную ценность.

2 метод производства ликопенового порошка

2.1 сравнение методов производства ликопенового порошка

В настоящее время, естьТри способа производства ликопена: экстракция растений, химический синтез и биосинтез. Метод экстракции растений в основном включает извлечение и очистку ликопена из спелых фруктов растений, таких как помидоры. Однако этот метод зависит от различных факторов, таких как регион, сезон, разновидность помидоров и зрелость, и поэтому является нестабильным. В китае ликопен в основном добывается из помидоров, выращиваемых в синьцзяне (с длительными солнечными днями). Однако содержание ликопена в томатах очень низкое, как правило, всего 20 мг/кг, и даже в томатной коже, где содержание выше, оно составляет менее 0,4 г/кг [12].

Стоимость извлечения высока, и экстракт часто содержит другие каротеноиды, которые влияют на чистоту продукта. А поскольку содержание является низким, процесс экстракции потребляет большое количество органических растворителей, что оказывает большее воздействие на загрязнение окружающей среды. Метод химического синтеза в основном предполагает виттиговую реакцию октатриендиального и трифенилфосфина хлорида или трифенилфосфина сульфида на синтез ликопена [13]. Химический метод синтеза имеет характеристики высокой урожайности (более 65%), дешевого и пригодного для утилизации сырья, а также мягкие условия реакции. Хотя метод химического синтеза имеет высокую урожайность и низкую стоимость, он подвержен изомеризму из-за многочисленных двойных связей в структуре ликопена, и существует риск для безопасности, поскольку продукт может содержать остатки растворителей. Метод биосинтеза относится к процессу, в котором микроорганизмы ферментируют иПроизводить ликопен, используя избытокИ доступных сырьевых материалов, таких как сахар, кукурузный сироп и неорганические соли. Метод микробной ферментации не только обеспечивает безопасность метода экстракции растений (оба метода естественным образом вытекают из биологического метаболизма и не синтезируются искусственно), но и имеет преимущества дешевого и масштабного производства метода химического синтеза. Считается, что это идеальный метод для будущего производства ликопена.

2.2 биосинтетический путь ликопенового порошка

Ликопен является тетратероидным соединением, подобным другим терпеноидам- да. Основными прекурсорами биосинтеза являются два isopentenyl блока IPP (isopentenyl pyroфосфат) и DMAPP (диметилаллилпирофосфат), которые являются изомерами друг друга [14]. В настоящее время существует два способа синтеза IPP и DMAPP в природе: Один-это путь MEP (2- метил-эритритол -4- фосфат) в прокариотах и растениях, а другой-путь MVA/данные отсутствуют.(мевалонат) в эвкариотах.

Путь меп (2- метил-эритритол -4- фосфат) в прокариотах и растениях и путь мва (мевалонат) в эукариотах.

Путь MEP использует пирувацию и 3- фосфоглицерат в качестве начальных субстратов для синтеза IPP и DMAPP [15], в то время как путь MVA использует ацетилкоэнзим A в качестве исходного субстрата для синтеза IPP и DMAPP через семиступенчатую ферментатическую реакцию [16]. По сравнению с европ, ранее был изучен маршрут дсоп, а его механизм реакции является более тщательным. Биосинтетический путь ликопена можно разделить на два модуля. Верхний модуль представляет собой процесс синтеза веществ-прекурсоров IPP и DMAPP, а нижний модуль-процесс синтеза ликопена из IPP и DMAPP (общий обзор см. на рис. 1). IPP и DMAPP проходят поэтапные конденсационные реакции под действием isopentenyl transferase для создания GGPP, а затем GGPP (geranylgeranyl пирофосфат) преобразуется вОктагир-ликопенДействие октагидроликопеновой синтазы (phytoene synthase, CrtB), а затем в ликопен действие октагидроликопеновой дегидрогеназы (phytoene desaturase, CrtI).

2.3 микроорганизмы, синтезирующие ликопен

Известные в настоящее время микроорганизмы, которые ферментируются для производства1. ЛикопенВключают: pantoea, которая может синтезировать сам ликопен, Blakeslea trispora, и метаболически модифицированные дрожжи, Yarrowia lipolytica и Организация < < эшерихия > >coli. Среди них, блакеслеа триспора была изучена более [17] и является единственным штаммом, который может достичь промышленного производства грау-каротина. Ликопен, промежуточный продукт в синтезе грау-каротина, может накапливаться путем добавления ингибитора ликопен-цикликазы в процессе ферментации. Несколько исследований показали, что производство ликопена компанией Blakeslea trispora постоянно улучшается, и самый высокий уровень производства ликопена, по сообщениям, составляет 3,4 г/л [18]. Тем не менее, трихотезеновая плесень подвержена дегенерации во время субкультуры, что приводит к нестабильным урожаям. Кроме того, длительный цикл роста делает его менее продуктивным, а необходимость добавления ингибиторов во время производства также значительно ограничивает процесс ферментации ликопена трихотезеновой плесенью [19].

3 исследования по биотехнологическому синтезу ликопена

3.1 инженерная модификация основных микроорганизмов для синтеза ликопена

Escherichia coli является одним из наиболее часто используемых микробных хостов для гетерологического синтеза терпеноидов. Преимущества, такие как четкий генетический фон, быстрый рост клеток и множество инструментов генетических манипуляций, делают E. coli идеальной платформой для разработки промышленной продукции. Некоторые ученые успешно разработали кишечную палочку для гетерологического производстваВысокопроизводительные каротеноидыПосредством метаболической инженерии и синтетической биологии [20-21]. Однако из-за риска подверженности кишечной палочки инфекции фаге и наличия эндотоксинов [22] использование кишечной палочки для производства ликопена в настоящее время создает определенные риски для безопасности пищевых продуктов, и поэтому ее промышленное применение ограничено.

- сачаромицисОбщее состояние здоровья— это эукариотический модельный организм, геном которого был секвенирован, клеточная биология которого была хорошо описана и для которого существуют зрелые инструменты и методы генетических манипуляций. При крупномасштабной ферментации - сачаромицисОбщее состояние здоровьяопасность заражения фагами отсутствует, и, как правило, считается более безопасной, чем Escherichia coli. Поэтому использование метаболической инженерии для преобразования сахаромицидных церебрысий для гетерологического производства ликопена считается перспективным с точки зрения его применения. Как Escherichia coli, Saccharomyces Общее состояние здоровьяне можетСинтезируйте каротеноидыСамостоятельно и должны вводить соответствующие синтезирующие гены [23-26].

Ярровия липолитика является нетрадиционным микробным хостом, который производит большое количество липидов и считается безопасным. Хотя он не может непосредственно синтезировать каротеноиды, он может производить большое количество прекурсора ацетилкоэнзима а, а синтез каротеноидов может быть достигнут путем введения экзогенных ключевых ферментов. Исследователи разработали много генетических инструментов для инженера липомицевых дрожжей, который считается перспективным носителем дляПроизводство каротеноидов по маршруту мва[27-28].

Эвкариотические микроводоросли, как автотрофические микроорганизмы, могут использовать световую энергию и двуокись углерода для производства биомассы и поэтому обладают большим метаболическим потенциалом для устойчивого производства терпеноидов. Однако текущие исследования метаболической инженерии высокогорных водорослей значительно отстают от исследований других носителей, что в определенной степени ограничивает их применение [29].

Красные дрожжи Rhodosporidium торулоиды могут производить пигменты, такие какАу-каротин и ау-каротинЧерез внутриклеточный биосинтез. Исследователи укрепили его потенциал производства каротеноидов путем оптимизации культурных условий и мутагенеза. Однако в настоящее время исследования по красным дрожжами весьма ограничены, возможно, из-за ограниченности имеющихся геномных данных и отсутствия функциональной аннотации ключевых генов, что в значительной степени препятствует метаболической инженерии высокопроизводительных каротеноидов [30]. Другие некаротеногенные дрожжи, такие как Pichia is, которые могут расти с высокой плотностью без накопления этанола, также были разработаны для синтеза каротеноидов, но урожайность низка и требует изучения [31].

3.2 стратегии синтеза ликопена инженерными микроорганизмами

1. Совершенствование модуля начальной подготовки (поставка прекурсоров IPP/DMAPP)

Для достижения высоких урожаев каротеноидов, таких как ликопен, эффективной стратегией является увеличение синтеза общих прекурсоров IPP и DMAPP. Синтез IPP и DMAPP включает два естественных пути: путь MEP и путь MVA. (a) путь MEP в основном находится в прокариотах. DXС. Sи IDI, как правило, рассматриваются в качестве основных ферментов, ограничивающих цены в этом пути, и были чрезмерно перегружены для повышения изопреноидного синтеза [32]. Li et al. [33] пришли к выводу, что испа, исф и испе еще больше увеличили поток пути в ДКС и иди чрезмерно напряженных штаммах. Чрезмерная уплотнение ispG может эффективно сократить отток мек в ячейке, что приведет к значительному увеличению производства изопреноидов на выходе [34]. Исходя из этого, ли и др. [35] успешно вырослиПроизводство ликопена на 77%Путем активации IspG и IspH для предотвращения накопления промежуточных веществ MEP. (b) путь два в основном находится в эукариоте. Редуктаза HMG-CoA — это первый шаг в биосинтезе изосферных соединений через два [36]. Избыток редуктазного каталитического региона HMG-CoA (tHMG1) в Saccharomyces cerevisiae может увеличить производство ликопена [24]. Кроме того, несмотря на определенный прогресс, достигнутый в производстве каротеноидов за счет оптимизации европеоидного пути, регулятивные механизмы естественных хозяев европеоидного пути ограничивают его применение [37]. Для того, чтобы обойти этот путь, чжу файин и др. [20] ввели полный путь MVA и экзогенные гены в Escherichia coli и получили выход ликопена 1,44 г/л путем оптимизации пакетного откорма и ферментации.

(2) Исследования по нижестоящим модулямГетерологический синтез ликопена- да. Общая стратегия заключается в Том, чтобы ввести гетерогены путей в некаротеноидные носители для производства каротеноидов, преобразуя прекурсоры синтеза терпенов IPP и DMAPP в каротеноиды. Verwaal et al. [38] выразили плазмиду в E. coli, содержащую гены, кодирующие гираннилгеранилпирофосфат-синтазу и октагидроликопен-синтазу, а также cDNA-кодирование ликопен-десатуразы, и в конечном итоге наблюдали накопление ликопена. Введение копий CrtI и tHMG1 в каротеноидные синтезирующие дрожжевые клетки увеличило содержание гравитационного каротина. Для достижения высокого уровня и генетически стабильного выражения гетерологических генов пути, Tyo et al. [39] создали систему выражения без плазмы, с высокой генной копией для химически индуцированной хромосомной эволюции, которая была использована в инженерии E. coli и в конечном итоге увеличила производство ликопела на 60% по сравнению с системой выражения плазмиды. Исследования показали, что оптимизация пути синтеза ликопена очень важна для гетерологического высокопродуктивного ликопена.

3. Регулировка объездного пути

4. Организация Объединенных НацийПрекурсор синтеза ликопена, FPP, также является общим прекурсором многих метаболитов дрожжей (таких как ubiquinone, terpene спирты, сквален и т.д.). Тем не менее, прямое нокатирование этих генов-прекурсоров конкурентного пути (таких как ген синтеза сквалена) окажет большое влияние на рост клеток. Поэтому многие ученые стремятся к снижению регулирования этих конкурентных путей для увеличения синтетического потока ликопена. Замена слабой промоутер на естественную промоутер для снижения конкурирующей скволеновой синтазы ген sqs1 может увеличить утомительную производительность грава-каротена с (453.9 градиента 20,2) мг/л до (797.1 градиента 57,2) мг/л в Yarrowia lipolytica [40]. Xie Wenping et al. [41] использовали высокую индукцию глюкозы/низкий подавитель глюкозы pHXT1 контроль в Saccharomyces cerevisiae для достижения последовательного выражения генов erg9 и каротеноидных путей в ответ на изменения концентрации глюкозы в культуре, что привело к значительному увеличению производства ликопена в дрожжевых дрожжевых культурах. Hong et al. [42] выбили гены dpp1 и lpp1 из Saccharomyces cerevisiae, чтобы подавить конкурирующие пути для производства фарнесола, и подавили производство эргостерола, занижая выражение erg9, что также увеличило производство ликопена. Вышеуказанные исследования в полной мере продемонстрировали, что ослабление регулирования конкурирующих путей является эффективной стратегией увеличения производства ликопена.

4. Трансформация шасси

В дополнение кОптимизация гетерологического синтеза ликопена, трансформация шасси хоста также необходима для соответствия гетерологическому пути. Модификация шасси включает: увеличение потока прекурсоров ацетилкоа [43], увеличение предложения таких факторов, как атф и надф, вырубку некоторых несущественных генов и адаптивную эволюцию штамма. Ацетил-коа является субстратом для биосинтеза каротеноидов. Чен ян и др. [24] подробно изучили механизм действия гена ypl062w в Saccharomyces cerevisiae. Удаление ypl062w может увеличить поток ацетилкофермента а и в конечном итоге увеличить производство ликопена до 1,65 г/л. Чжоу и др. [26] использовали адаптивную эволюцию Saccharomyces cerevisiae в сочетании с технологиями метаболической инженеры для достижения продуктивности ферментации пакетной подачи 8,15 г/л ликопена. Важным фактором, влияющим на синтез каротеноидов, является подача атф в виде энергии и надф в виде понижающей мощности. Модифицировав центральные метаболические модули для ассимиляции источников углерода (эмп и ППС), было увеличено снабжение СПС и NADPH, и с помощью инженерной E. coli можно синтезировать 2,1 г/л параметрического каротина в пакетной ферментации [44]. Модуляция выражения генов sucAB и sdhABCD может увеличить поток углерода в цикле TCA и увеличить предложение атф. Кроме того, модуляция гена тальба может увеличить предложение надф, что увеличивает выход ликопенового синтеза на E. coli до 3,52 г/л [45].

(5) Систематическая метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства высокопродуктивного ликопена. Резюме показано на рис. 2 и 3.

Ши бин и др. [25] систематически разрабатывали Saccharomyces cerevisiae для обеспечения эффективностиБиосинтезированный ликопен через метаболическую инженерию, и перечислил четыре ключевых вопроса: (а) накопление вторичных метаболитов и рост принимающих клеток должны быть сбалансированы; (b) необходимо усилить гетерологический синтез ликопена в дрожжевых составах; (c) дрожжевые шасси должны быть модифицированы, чтобы обеспечить больше веществ-прекурсоров и уменьшить мощность; (d) необходимо оптимизировать технологию ферментации дрожжей. И предложил соответствующие решения, в Том числе: (a) скринирование группы GAL promoters, которые могут разумно контролировать гетерологический синтез ликопенов, отделяя рост дрожжевых клеток от накопления ликопенов продуктов с точки зрения последовательности времени, и прочность promoter также сопоставима с учредительным сильным promoter в период синтеза продукта; (b) комплексное изучение трех основных генных источников гетерологического синтеза ликопена, получение нового оптимального сочетания PaCrtE, PagCrtB и BtCrtI, эффективно функционирующих в Saccharomyces cerevisiae. (c) был также проведен ряд модификаций шасионных клеток Saccharomyces cerevisiae для обеспечения достаточного количества прекурсоров для синтеза ликопена, ацетилкоэнзима а и уменьшения мощности NADPH (сокращенный коэнзим II), а также вырубки некоторых эндогенных несущественных генов, которые влияют на накопление ликопена, в целях дальнейшего увеличения производства ликопена; (d) с помощью этих систем метаболической инженерии методы, в сочетании с преобразованием Saccharomyces cerevisiae процессов ферментации для эффективного биосинтезирования размера ликопена.

Он перечислил четыре ключевых вопроса: (а) необходимо сбалансировать накопление вторичных метаболитов и рост клеток организма; (b) сГетерологический синтез ликопенаНеобходимо повысить эффективность дрожжей; (c) дрожжевые шасси должны быть модифицированы, чтобы обеспечить больше веществ-прекурсоров и уменьшить мощность; (d) необходимо оптимизировать технологию ферментации дрожжей. И предложил соответствующие решения, в Том числе: (a) скринирование группы GAL promoters, которые могут разумно контролировать гетерологический синтез ликопенов, отделяя рост дрожжевых клеток от накопления ликопенов продуктов с точки зрения последовательности времени, и прочность promoter также сопоставима с учредительным сильным promoter в период синтеза продукта; (b) всеобъемлющий скрининг трех ключевых генных источниковГетерологический синтез ликопена, получение нового оптимального сочетания PaCrtE, PagCrtB, и BtCrtI, которые эффективно функционируют в Saccharomyces cerevisiae. (c) был также проведен ряд модификаций шашечных клеток Saccharomyces cerevisiae для обеспечения достаточного количества прекурсоров для синтеза ликопена, таких как ацетилкоэнзим а и уменьшение мощности NADPH (сокращенный коэнзим II), а также выведения из организма некоторых эндогенных несущественных генов, которые влияют на накопление ликопена, в целях дальнейшего увеличения производства ликопена; (d) благодаря этим системам метаболические методы инженерии в сочетании с оптимизацией ферментации синтетических сред сахаромициевидными цепочек, выход ликопена достигал 3,28 г/л, который первоначально достиг промышленного уровня. В настоящее время масштабы ферментации в китайском стиле были успешно расширены до 6000 л. кроме того, стратегия метаболической инженерии, разработанная для Saccharomyces cerevisiae, была также успешно расширена до биотехнологического синтеза других соединений терпеня, таких как β-farnesene [46], bergapten [47] и других sesquiterpenes, таких как β-caryophyllene. Среди них Дэн сяомин и др. [47] использовали эту системную инженерную стратегию для повышения урожайности бергаптена, производимой метаболической инженерией штаммов Saccharomyces cerevisiae, до 34,6 г/л.

3.3 процесс ферментации ликопенных бактерий

В настоящее время исследования по ферментацииВысокодоходный ликопенМикроорганизмы также добились значительного прогресса. Ферментационное сырье, процессы и масштабы, используемые различными штаммами, будут различаться (резюмируется в таблице 1). Субстратная матрица, используемая в процессе ферментации, варьируется в зависимости от типа микроорганизма. Ферментационные хозяев с более зрелым гетерологическим синтезом ликопена, как правило, Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. В целом, ферментация Escherichia coli использует глицерол в качестве источника углерода [20, 45], в то время как Saccharomyces cerevisiae использует главным образом глюкозу в качестве источника углерода [23-26].

Чжу фаин и др. [20] использовали глицерол в качестве источника углерода для производства эшерихии коли и получили aВыход ликопена 1,44 г/лИспользование полностью синтетической среды в 5 л ферментере. Впоследствии ферментационная шкала была расширена до 150 л, что дало 1,32 г/л, что указывает на возможность увеличения штамма для производства. Sun et al. [45] использовали инженерную кишечную палочку E. coli для ферментации 7 л с использованием глицерола в качестве источника углерода при кормлении партии и в конечном итоге получили 3,52 г/л ликопена. Чэнь янь и др. [24] использовали инженерные Saccharomyces cerevisiae для ферментации глюкозы и этанола в качестве источников углерода и дрожжевого экстракта, а пептон в качестве источников азота в ферментере емкостью 5 л с использованием метода пакетного откорма.

По их итогамПолучен ликопеновый титр 1,65 г/л.Ши бин и др. [25] использовали инженерные Saccharomyces cerevisiae для проведения двухэтапной пакетной ферментации 7 л ферментера с использованием глюкозы и этанола в качестве источников углерода и сульфата аммония в качестве источника азота. Остатки глюкозы и этанола в броте ферментации строго контролировались, и был получен окончательный ликопеновый титер в размере 3,28 г/л. Так как Saccharomyces cerevisiae имеет много преимуществ по сравнению с Escherichia coli, таких как высокая безопасность продуктов питания и устойчивость к инфекции фаге, исследования ферментации ликопена Saccharomyces cerevisiae являются более перспективными. В настоящее время природные среды YPD, которые часто используют пептон и дрожжевой экстракт в качестве источников азота для ферментации дрожжей [24, 26], а также полусинтетические среды с сульфатом аммония, дрожжевой экстракт и пептон в качестве смешанных источников азота [23] и полностью синтетические среды с сульфатом аммония в качестве источника азота [25]. Полностью синтетические носители обладают преимуществами дешевизны, простоты многократного брожения и масштабации, а также имеют четкий состав, удобный для последующей оптимизации. В будущем следует провести дополнительные исследования по ферментации синтетических дрожжевых сред, с тем чтобы сделать производство ликопена высоким и стабильным, повторяемым и масштабируемым, закладывая прочную основу для последующего промышленного применения.

3.4 извлечение и количественная оценка ликопена, синтезированного микроорганизмами

Каротиноиды, такие какЛикопен обладает сильными антиоксидантными свойствами, и риск окисления и изомеризации должен быть минимизирован в процессе экстракции [49]. Например, в некоторых исследованиях принято решение работать в условиях световой защиты [20, 45] или добавлять антиоксидантный BHT в экстракционный агент [24-25, 27]. Широко используемыми экстракционными растворителями являются ацетон, нефтяной эфир, хлороформ, гексан, этилацетат и т.д. [49]. Поскольку ликопен является внутриклеточным продуктом, требуется разрушение клеточной стенки, и метод разрушения клеточной стенки варьируется в зависимости от толщины стенки хоста. Например, клеточная стенка Escherichia coli относительно тонкая, ацетонная подвеска обычно используется, за ней следует разрушение клеточной стенки в 55 - гравной водяной ванне [20, 45]; Эвкариотические организмы, такие как липидорастворимые дрожжи и Saccharomyces cerevisiae, имеют более толстые клеточные стенки, а стеклянные бусины и экстракционные реагенты, как правило, добавляются для разрушения клеток путем тряски [25, 27]; Стенки дрожжевых элементов также могут быть сломаны путем кипения в водяной ванне соляной кислотой [23-24].

Методы, используемые для обнаружения иКоличественная оценка каротеноидов, таких как ликопенКроме того, существующие исследования отличаются друг от друга. В большинстве исследований используется высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC) для обнаружения каротеноидов, таких как ликопен и грау-каротин [23-26, 45], в то время как в некоторых используется ультрафиолетоспектрофотометрия [20, 27]. Поскольку детекторы ультрафиолетового спектрофотометра подвергаются воздействию примесей с одной и той же длиной абсорбционной волны, а метод HPLC обнаруживает, сначала разделяя различные вещества, а затем обнаруживая абсорбционную величину. Относительно говоря, точная количественная оценка каротеноидов, таких как ликопен, с помощью ГПЛК является более точной, в то время как ультрафиолетовая спектрофотометрическая детекция может использоваться в качестве дополнительного средства для первоначальной оценки тенденции изменения урожайности в процессе ферментации.

В большинстве исследований использовалась стандартная кривая с соответствующими стандартами ликопена и грава-каротина для расчета доходности [23-26, 45], но не указывалось, была ли приобретенаЛикопен/грау-каротинБыла проведена калибровка стандартов. Лишь несколько исследователей прямо заявили, что концентрация стандартного раствора была калибрована до построения стандартной кривой [25]. Причина, по которой концентрация готового стандартного раствора должна быть калибрована, заключается в Том, что трудно точно взвесить небольшое количество ликопена или грау-каротина стандарта и нелегко точно определить, полностью ли растворены кристаллы ликопена в органическом растворителе. Кроме того, чистота приобретаемого стандарта может также меняться из-за методов хранения и времени. Эти объективные факторы могут привести к большим ошибкам при построении стандартной кривой ликопена, в результате чего расчетная доходность может быть не очень точной. Для устранения влияния вышеуказанных факторов обычно используется спектрофотометр для измерения абсорбации подготовленного ликопена и других стандартных каротеноидов, а затем для расчета абсолютного содержания каротеноидов в растворе по соответствующему коэффициенту вымерения [25, 50-51]. Этот метод позволяет устранить ошибки, вызванные неправильным взвешиванием или неполным растворением образца. Таким образом, HPLC используется для точного обнаружения ликопена в пробе, а стандартная кривая строится с использованием калиброванного стандартного решения, и количественные результаты будут более точными.

4. Выводы и перспективы

Ликопен, как сильный антиоксидант, имеет много хороших физиологических функций и имеет широкую рыночную перспективу. В настоящем документе представлен подробный обзор физико-химических свойств, физиологических функций иМетоды производства ликопена, и основное внимание уделяется обобщению текущего научно-исследовательского прогресса в производстве ликопена с помощью биотехнологии, включая разнообразный выбор микробных хостовых клеток, новейшие стратегии метаболической инженерии, методы ферментации и извлечения ликопена и точные методы количественной оценки.

Хотя был достигнут определенный прогресс в биотехнологическом синтезе ликопена, все еще существует много проблем с этимПроцесс биосинтеза ликопенаПотому что это сложный инженерный исследовательский проект со многими влияющими факторами. Ниже кратко излагаются соответствующие направления исследований на будущее:

(1) я Расширение и стабильная репликация ферментационного производства. В настоящее время большинство исследований по биотехнологическому синтезу ликопена все еще находится на лабораторном этапе проведения экспериментов по созданию небольших ферментационных резервуаров, в то время как промышленные исследования часто основываются на крупномасштабном производстве ферментации, рассчитанной в тоннах или десятках тонн. Расширение масштабов ферментации от мелкомасштабного до опытного производства является не просто линейным увеличением объема резервуаров, но также связано со многими проблемами, такими как неравномерная теплопередача, массовая передача и кислородная передача, а также изменения в модели роста штамма. В соответствии с авторством#39. Практический опыт: в процессе ферментации могут возникать такие проблемы, как преждевременное старение штаммов, деформация фенотипа штамма, изменения в стратегиях откорма и неустойчивая ферментация. Исследователям необходимо индивидуально скорректировать параметры и условия усиления процесса ферментации. Будущие исследования по расширению масштабов ферментации производства являются ключом к решению проблемы промышленностиПроизводство ликопена с использованием биотехнологии.

(2) извлечение иПроцесс очистки ликопенаИз микробных источников. Ликопен является внутриклеточным продуктом, и процесс извлечения и очистки включает в себя многие этапы, такие как нарушение работы клеток, удаление примесей и кристаллизация ликопена. В ходе этого процесса ликопен легко окисляется, что приводит к структурным изменениям. Таким образом, уровень извлечения трудно обеспечить, и необходимы углубленные исследования процесса извлечения и очистки ликопена из микробных источников.

(3) исследованияТестирование качества микробного ликопена.Хотя микробный ликопен также является продуктом ферзиматического катализатора, он не производится из натуральных томатов и может быть связан с такими вопросами, как генетическая модификация. Поэтому микробный ликопен должен быть сначала структурно идентифицирован для обеспечения его соответствия природным источникам помидоров, а затем необходимо провести проверку качества продуктов, таких, как остатки тяжелых металлов и микробное содержание. Важным фактором, влияющим на рынок применения микробного ликопена, является обеспечение структуры и качества продукции.

(4) контроль производственных издержек: если он хочет конкурировать на рынке сДобытый естественным путем ликопен,Биотехнологически синтезированный ликопен должен иметь значительные преимущества с точки зрения затрат. Основные затраты на биологическую ферментацию для производства ликопена включают в себя ферментационное сырье, амортизацию оборудования, добычу и очистку, рабочую силу и маркетинг. При проектировании и оптимизации условий производственного процесса необходимо учитывать факторы затрат, такие как использование более дешевых полностью синтетических ферментационных сред, распределение затрат за счет увеличения ферментации и использование более передовых методов, таких как нарушение работы ферментации ферментами, для извлечения ликопена в целях сокращения производственных затрат.

Решение этих проблем имеет большое теоретическое и практическое значение для содействия индустриализацииПроизводство ликопена с помощью биотехнологии, а также может служить справочным материалом для исследований по биотехнологическому производству других природных продуктов с высокой добавленной стоимостью.

Ссылки на статьи

[1] защитное воздействие мк -4 на окисление градиеноидов карота в имитированном желудочном соке [J]. Журнал Huazhong Agri⁃ cultural Университет,2020,39(2): 102 — 111(in Китайский язык (english) С резюме на английском языке.

[2] лю К 'кей, лю X Y, ван Q,et Al. Оптимизация Ii. Основные направления деятельности - ингредиент Соотношение между мужчинами и женщинами Соединенные Штаты америки На территории комплекса Фрукты и фрукты и - овощные продукты Вино, богатое ликопеном по d-оптимальной конструкции смеси [J]. Китай brew⁃ ing,2022,41(2):164-169

[3] ZARDINI A A,MOHEBBI M,FARHOOSH R,et al и 3. Определение характеристик Соединенные Штаты америки Структура наноструктуры - липид. Носители и твердые липидные наночастицы, содержащие ликопен для пищевых продуктов fortifi⁃ cation[J]. Журнал по теме В области продовольствия Наука и техника и Технологии,2018,55 (1):287 — 298.

[4] LEE С. О.T,CHEN B H. стабильность ликопена во время нагрева И освещенность в модельной системе [J]. Пищевая химия,2002, 78(4):425 — 432.

[5]WANG X W,XIA Y B,WANG К. К.Q.Stability Соединенные Штаты америкиnatural lycopene[J]. Журнал хунанского сельскохозяйственного университета,2002,28(1):57-60 (на китайском языке с аннотацией на английском языке).

[6]MA T g.физиологические функции и применение Из ликопена [J]. Зерновые и прочие продукты Масла,2008,21(1):46-48(в тиграх. Nese с резюме на английском языке.

[7]LI J,YAN W,LIU Y H,et al. Research progress on health funcДоклад генерального секретаряи3. ПрименениеСоединенные Штаты америкиlycopene[J]. Сельское хозяйство и технологии,2016,36(15):5-6 (на китайском языке).

[8]JIANG L H,LIU H F,HAO G F, и др. научно-исследовательский прогресс по антиоксидантной способности AstaxanthВ случае необходимости[J]. Наука и технологии пищевой промышленности,2019, 40(10):350 — 354.

[9]PENG Y J, LU H P, WANG S N, и др. настоящее исследование и перспективы в области природных ресурсов AstaxanthВ случае необходимости[J]. Китай (Китай) - продукты питания Присадки,2017(4): 193 — 197.

[10] ASSAR E A,VIDALLE M C,CHOPRA M, и др. ликопен действует через ингибирование IκB kinase, чтобы подавить NF-κB сигнал ⁃ ing в клетках простаты и рака молочной железы [J]. Опухоли biolo⁃ gy,2016,37(7):937 -9385.

[11] рао A  - ви, агарвал S. роль организации - антиоксидант 1. Ликопен При раке и болезни сердца [J]. Журнал американского колледжа питания,2000,19(5):563-569.

[12]HUO S X,YANG Q S,YUE X H,et al.Determination Метод проведения испытанияСоединенные Штаты америки1. Ликопенcontent В томатной коже [J]. Пищевая промышленность,2019,40(6):263-265 (на китайском языке с резюме на английском языке).

[13] KARL M.Method дляВ настоящее времяmanufacture Соединенные Штаты америкиcarotinoids иnovel ates:US5208381[P].1993-05-04.

[14] KIRBY J,KEASLING - J.D.Biosynthesis Соединенные Штаты америкиplant isoprenoids: перспективы для На микробной основе Машиностроение [J]. Годовой отчет о проделанной работе Ii. Обзор Соединенные Штаты америки Биология растений,2009,60:335-355.

[15] ROHMER M,KNANI M,SIMONIN P, и др По адресу: Isopentenyl diфосфат [J]. В настоящее время Биохимический журнал, 1993,295(Pt 2):517-524.

[16] BLOCH K,CHAYKIN S,PHILLIPS A H,et al. Журнал биологической химии,1959,234(10):2595-2604.

[17] шудхари S  М, ананатанараян Я буду петь. HAL R S. использование метаболических стимуляторов и ингибиторов для en⁃ Производство грау-каротина и ликопена компанией Blakeslea tri β Spora NRRL 2895 и 2896[J]. Технология биоресурсов,2008, 99(8):3166-3173.

[18] анатес т м р, де кастротес а е, перец J  C. повышение эффективности method  Соединенные Штаты америки Производство и сбыт Ликопен, подготовка для Получение дополнительной информации Ликопен, и application  Из них: CN1617934A[P].2005-05-18.

[19] WANG J F,LIU X J,LIU R S, и др. оптимизация мат ⁃ Организация < < эд > > 3. Ферментация В рамках процесса для В настоящее время Производство и продажа of  1. Ликопен По запросу: Blakeslea trispora NRRL 2895(+) и NRRL 2896 (по запросу) [J]. 1. Биопроцесс и Iv. Биосистемы Инжиниринг,2012,35(4): 553 — 564.

[20] ZHU F Y,LU L,FU S,et al.target Инженерное дело иscale of lycopene Избыточное производствоin Escherichia coli[J]. Биохимия процессов,2015,50(3):341 — 346.

[21] PARК. К.S Y,BINKLEY R M,KIM W J,et al.⁃ ic engi Ниринг Escherichia coli для высокого уровня astaxanthin produc⁃ Высокая производительность [J]. 3. Метаболизм Машиностроение,2018, 49:105-115.

[22] RAY B L,RAETZ C R. биосинтез грам-отрицательный эндотоксин#39;- фосфат липидов A[J]. Journal of biologi⁃ cal chemistry,1987,262(3):1122-1128.

[23] XIE W P,LV X M,YE L D,et al. Инженер-метаболист,2015,30:69-78.

[24] CHEN Y,XIAO W H,WANG Y,et al.Lycopene overproduc⁃ tion in Saccharomyces cerevisiae through Сочетание проходной инженерии с принимающей инженерией [J/OL]. Фактические микробные клетки,2016,15(1):113[2023-03-13]. https://microbialcellfac⁃.    Биометрический центр.    Com/статьи/10.1186/s12934 -016- 0509-4.

[25] ши б, ма т, е з л и др. системная метаболическая инженерия - из сакчаромицин cerevisiae  for  lycopene  overПроизводство и продажа [J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,2019,67(40): 11148-11157.

[26] чжоу К, ю C, лян (Китай) N,et, Al. Адаптивная система Iii. Эволюция И метаболическая инженерия повышает производство ликопена в Saccharo⁃ myces cerevisiae за счет увеличения предложения и использования прекурсоров [J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,2023,71(8): 3821-3831.

[27] GAO S L,TONG Y Y,ZHU L,et al. Итеративная интеграция Многократная копия генов пути в Yarrowia lipolytica для heter⁃ - по логике - о, каротин Производство [J]. 3. Метаболизм Машиностроение, 2017,41:192-201.

[28] LARROUDE M,CELINSKA E,BACK A, и др. синтетический биологический подход к преобразованию Ярровия липолитика в com⁃ petitive биотехнологический производитель β-carotene[J]. Биотехнол и биоинженерия,2018,115(2):464 — 472.

[29] GUERIN M,HUNTLEY M E,OLAIZOLA M.Haematococ⁃ cus astaxanthin:applications for human health иnutrition[J]. Тенденции в области биотехнологии,2003 год,21(5):210-216.

[30] диас с, силва с, фрейтас с, и др. влияние среднего pH на родоспоридиум торулоиды NCYC 921 каротеноид и губ ⁃ id production  Оценка была проведена По запросу: По направлению движения Цитометрия [J]. Применение на практике Биохимия и биотехнология,2016,179(5):776-787.

[31] BHATAYA A,SCHMIDT-DANNERT C,LEE P C. Meta⁃ bolic engineering of Pichia ⁃ is X-33 for lycopene produc tion[J]. Биохимия процессов,2009,44(10):1095 — 1102.

[32] YANG J M,GUO L Z. Biosynthesis О-каротин в Engi ⁃ neered E.coli используя пути MEP и MVA [J]. Microbi⁃ al cell factory,2014,13:160.

[33] LI Y F,LIN Z Q,HUANG C,et al.⁃ ic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 ated genome edit ing[J]. Метаболическая инженерия,2015,31:13-21.

[34] чжоу к, цзоу р и, стефанопулос г, и др. метаб ⁃ olite профилирование Идентифицирован метилеритритол - циклодифосфат Ef ⁃ flux как ограничивающий шаг в производстве микробного изопреноида [J]. График 1,2012,7(11):e47513.

[35] LI Q Y,FAN F Y,GAO X,et al.⁃ activation of IspG иIspH to MEP intermediate аккумуляции и im isoprenoids production in Escherichia coli[J]. Метаболическая инженерия,2017,44:13-21.

[36] димстер-денк - ди, терзание M  K, рин (RINE) J. регулирование обратной связи между 3- гидроксией -3- метилглутарилкоферзимом A re⁃ ductase в Saccharomyces cerevisiae[J]. Молекулярная биология клетки,1994,5(6):655 — 665.

[37] MARTIN V J J,PITERA D J,WITHERS S T,et al. Engi⁃ Ниртинг мевалонатный путь в эшерихия коли для профилактики tion  of  Терпеноиды [J]. Природа и природа Биотехнология,2003,21(7): 796-802.

[38] VERWAAL R,WANG J,MEIJNEN J P,et Производство на высоком уровне of  Бета-каротин in  Saccharomyces  cerevisiae  Путем последовательного преобразования с каротеногенными генами из Xan⁃ thophyllomyces Dendrorhous [J]. Применение на практике and  Экологическая микробиология,2007,73(13):4342-4350.

[39] TYO K E J,AJIKUMAR P K,STEPHANOPOULOS G. стабилизация обстановки - генная инженерия B. дублирование усилий Для этого необходимо: На долгосрочную перспективу Свободный выбор гетерологичен Путь к успеху Выражение [J]. Природа и природа Биотехнология, 2009,27(8):760-765.

[40] килдегард K  Р, адиго-перез B, DOMENECH BELDA D,et al. Инжиниринг Yarrowia lipolytica для pro⁃ duction of astaxanthin[J]. Biotechnolo ⁃ gy,2017,2(4):287 — 294.

[41] XIE W P,YE L D, LU X M,et al.sequциальный контроль биосинтетических путей сбалансированного использования метаболических inter⁃ mediates в Saccharomyces cerevisiae[J]. Метаболический инженер грауинг,2015,28:8-18.

[42] HONG J,PARK S H,KIM S и др. эффективное производство ликопена in  Saccharomyces  cerevisiae  По запросу: 1. Фермент engineering and  Увеличение объема мембраны 3. Гибкость Производства и НПДХ [J]. Прикладная микробиология и биотехнология,2019,103(1): 211 — 223.

[43]LI J R,LIN J Y,LI Z Y,et al.Mining and ⁃ tic acid стресс -responsivegenes to improve lycopene syn Диссертация по рекомбинату Saccharomyces cerevisiae[J/OL]. 1. Микро-графы 1. Биология Китай,2023:1-24[2023-03-13].

[44] жао джей, ли Q Y,SUN T,et al.Engineering центральные метаболические модули Escherichia coli для улучшения β -carotene produc⁃ tion[J]. Метаболическая инженерия,2013,17:42-50.

[45] SUN T,MIAO L T,LI Q Y, и др Escherichia  Coli [J]. Биотехнологические письма,2014,36(7):1515-1522.

[46] YE Z L,SHI B,HUANG Y L,et al.Revolution of vitamin E production from microbial fernesene to isophytol[J/OL]. Нововведение,2022,3(3):100228[2023- 03-13].https://doi.org/10.1016/j.xinn.2022.100228.

[47] DENG X M,SHI B,YE Z L,et al.− identification Ocimum sanctum sesquiterpenoid synthases and () -eremophilene overproduction in engineered yeast[J]. Метаболический энджи,2022,69:122-133.

[48] LUO Z S,LIU N,LAZAR Z,et al.⁃ isoprenoid syn thesis в Yarrowia lipolytica путем выражения использования isopentenol Путь к успеху and  3. Модуляция 5. Внутриклеточные мышцы Гидрофобия [J]. Метаболическая инженерия,2020,61:344-351.

[49] CHOKSI P M,JOSHI V Y.A review on lycopene: экстракция, очистка, стабильность и применение [J]. < < международный журнал > > Пищевых свойств,2007,10(2):289-298.

[50] платформы BIAN G K,MA T,LIU T G.In vivo для перепроизводства терпеноидов and  the  Организация < < поколение > > of  По химическому оружию Разнообразие [J]. Методы в энзимологии,2018,608:97-129.

[51] Скотт K  J. выявление нарушений and  3. Измерение of  - каротеноиды Спектрофотометрия уф/вис [J]. Текущие протоколы в пищевой промышленности ана паралитическая химия,2001,F2.2(1):1-10.