Исследование метода производства ликопенового порошка

1. Ликопен is an important carotenoid that belongs По адресу:В настоящее времяterpene family Соединенные Штаты америкиtetraterpenoids. It is found В случае необходимостиnature mainly В случае необходимостиtomatoes, tomato products, иfruits such as watermelons иgrapefruits. It is В настоящее времяmain pigment in ripe tomatoes. Lycopene is a strong antioxidant with physiological functions such as anti-oxidation, anti-cancer иlowering blood lipids. It is widely usОрганизация < < эд > >in health foods, medicine, cosmetics иother fields [1-2]. At present, 1. Ликопенhas been widely used as a nutritional supplement иcoloring agent in many countries [3]. The global cumulative sales Соединенные Штаты америки1. Ликопенraw materials are increasing year По запросу:year, иthe market prospects are broad.

Ликопен порошокПроизводство и продажаmainly relies on two methods: plant extracДоклад генерального секретаряиПо химическому оружиюsynthesis. The plant extraction Метод проведения испытанияis limited По запросу:the season, иthe long plant growth cycle and low product content cannot ensure intensive and large-scale Производство и продажаСоединенные Штаты америкиthe product. The chemical synthesis method has problems such as chemical reagent residues, multiple isomeric forms, and environmental pollution. The biotechnology synthesis method has the advantages Соединенные Штаты америкиlow cost, short cycle, stable supply, and environmentally friendly and sustainable development. In recent years, it has attracted more and more attention from researchers.

В настоящее время значительный прогресс достигнут в исследованиях по биотехнологическому синтезу ликопенового пороха, таких, как диверсификация выбора микробных хостов, исследования и инновации в метаболической инженерии для преобразования путей, а также изучение процессов ферментации и усиления, что значительно повысило урожайность ликопенового синтеза, синтезированного биотехнологией. Однако большинство исследований по-прежнему сосредоточено на достижениях в одной технической области, и относительно мало систематических исследований и резюме биотехнологического синтеза ликопена.

Поэтому в настоящем документе рассматриваются физические и химические свойства ликопена и современные технологии производства, систематически обобщаются результаты исследований биосинтеза ликопена с использованием биотехнологии, представленной синтетической биологией, с уделением особого внимания сопоставлению методов ферментации различных штаммов и точных методов количественной оценки ликопена, а также предлагаются проблемы производства ликопена с использованием биотехнологии и будущие направления исследований, С целью обеспечения основы для промышленного производства ликопена с использованием биотехнологии и биосинтеза других натуральных продуктов с высокой добавленной стоимостью с использованием биотехнологии.

1. Физические и химические свойства и применение ликопенового порошка

Ликопен представляет собой тетратерпеновое соединение, ненасыщенное алкенилское соединение и каротеноид, не содержащий атомов кислорода. Ликопен имеет молекулярную формулу C40H56 и относительную молекулярную массу 536,85. В молекулярной структуре он имеет 11 конъюгированных двойных связей и 2 неконъюгированных двойных связей и часто существует в изомерах СНГ-транс. В природе, природный ликопен в основном все-транс, с очень небольшим количеством СНГ.

Lycopene powder is a fat-soluble pigment that is insoluble in water, but soluble in lipids and non-polar organic solvents. Its molecular structure contains a chromophore, which corresponds to a unique absorption region in the ultraviolet-visible absorption spectrum. The color depth varies from orange-yellow to dark red depending on the concentration Соединенные Штаты америкиlycopene, and may slightly change with the solvent. For example, 1. Ликопенcrystals dissolved in sunflower oil appear a visible dark red, while dissolved in petroleum ether appear yellow. Due to the relatively large number Соединенные Штаты америкиdouble bonds in the molecule, lycopene is very reactive and prone to oxidation and structural isomerization reactions under light, oxygen, and high temperature conditions, which can lead to a decrease in physiological activity [4]. Therefore, when lycopene is extracted, antioxidants such as vitamin C, vitamin E, 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT), and tert-butylhydroquinone (TBHQ) are often added [5].

В отличие от других- о, каротин, lycopene does not have the pro-active properties Соединенные Штаты америкиvitamin A, so its 3. Применениеwas not valued in the early days. However, in recent years, as the physiological functions Соединенные Штаты америкиlycopene have gradually become better known, its application has become more widespread. Lycopene is a powerful antioxidant that can scavenge oxygen free radicals in the human body and quench singlet oxygen. Its antioxidant capacity is about 100 times that Соединенные Штаты америкиvitamin E and twice that of Бета-каротин[6-9]. It has also been shown to have anti-tumor, prevent prostate disease and reduce the risk of cardiovascular disease [10-11]. It is widely used in cosmetics, health products and food. Lycopene has currently obtained the “novel food” approval of the European Union and the “generally recognized as safe” (GRAS) status in the United States. With the improvement of people' уровень жизни и растущее внимание к здоровью, Соединенные Штаты прогнозируют, что продажи ликопена будут расти на 35% в год. Таким образом, эффективная технология биосинтеза ликопена имеет большую рыночную ценность.

2 метод производства ликопенового порошка

2.1 сравнение методов производства ликопенового порошка

В настоящее время их триmethods дляПроизводство и сбытlycopene: plant extraction, chemical synthesis, and biosynthesis. The plant extraction method mainly involves extracting and purifying lycopene from ripe plant fruits such as tomatoes. However, this method is affected По запросу:various factors such as region, season, tomato variety, and maturity, and is therefore unstable. In China, lycopene is mainly extracted from tomatoes grown in Xinjiang (with long days of sunshine). However, the lycopene content in tomatoes is very low, generally only 20 mg/kg, and even in the tomato skin, where the content is higher, it is less than 0.4 g/kg [12].

Стоимость извлечения высока, и экстракт часто содержит другие каротеноиды, которые влияют на чистоту продукта. А поскольку содержание является низким, процесс экстракции потребляет большое количество органических растворителей, что оказывает большее воздействие на загрязнение окружающей среды. Метод химического синтеза в основном предполагает виттиговую реакцию октатриендиального и трифенилфосфина хлорида или трифенилфосфина сульфида на синтез ликопена [13]. Химический метод синтеза имеет характеристики высокой урожайности (более 65%), дешевого и пригодного для утилизации сырья, а также мягкие условия реакции. Хотя метод химического синтеза имеет высокую урожайность и низкую стоимость, он подвержен изомеризму из-за многочисленных двойных связей в структуре ликопена, и существует риск для безопасности, поскольку продукт может содержать остатки растворителей. Метод биосинтеза относится к процессу, в ходе которого микроорганизмы ферментируют и производят ликопен, используя обильные и легкодоступные сырьевые материалы, такие, как сахар, кукурузный сироп и неорганические соли. Метод микробной ферментации не только обеспечивает безопасность метода экстракции растений (оба метода естественным образом вытекают из биологического метаболизма и не синтезируются искусственно), но и имеет преимущества дешевого и масштабного производства метода химического синтеза. Считается, что это идеальный метод для будущего производства ликопена.

2.2 биосинтетический путь ликопенового порошка

Ликопен является тетратероидным соединением, подобным другим терпеноидам. Основными прекурсорами биосинтеза являются два isopentenyl блока IPP (isopentenyl pyroфосфат) и DMAPP (диметилаллилпирофосфат), которые являются изомерами друг друга [14]. В настоящее время существует два способа синтеза IPP и DMAPP в природе: Один-это путь MEP (2- метил-эритритол -4- фосфат) в прокариотах и растениях, а другой-путь MVA/данные отсутствуют.(мевалонат) в эвкариотах.

Путь меп (2- метил-эритритол -4- фосфат) в прокариотах и растениях и путь мва (мевалонат) в эукариотах.

Путь MEP использует пирувацию и 3- фосфоглицерат в качестве начальных субстратов для синтеза IPP и DMAPP [15], в то время как путь MVA использует ацетилкоэнзим A в качестве исходного субстрата для синтеза IPP и DMAPP через семиступенчатую ферментатическую реакцию [16]. По сравнению с европ, ранее был изучен маршрут дсоп, а его механизм реакции является более тщательным. Биосинтетический путь ликопена можно разделить на два модуля. Верхний модуль представляет собой процесс синтеза веществ-прекурсоров IPP и DMAPP, а нижний модуль-процесс синтеза ликопена из IPP и DMAPP (общий обзор см. на рис. 1). IPP и DMAPP проходят поэтапную конденсацию реакций под действием isopentenyl transferase генерировать GGPP, а затем GGPP (geranylgeranyl пирофосфат) преобразуется в октагидроликопен действием октагидроликопен synthase (phytoene synthase, CrtB), а затем в ликопен действием октагидроликопен dehydrogenase (phytoene desaturase, CrtI).

2.3 микроорганизмы, синтезирующие ликопен

К числу известных в настоящее время микроорганизмов, которые ферментируются для производства ликопена, относятся пантоэя, которая может синтезировать сам ликопен, Blakeslea trispora, и метаболически модифицированные дрожжи, Yarrowia lipolytica и Организация < < эшерихия > >coli. Среди них, блакеслеа триспора была изучена более [17] и является единственным штаммом, который может достичь промышленного производства грау-каротина. Ликопен, промежуточный продукт в синтезе грау-каротина, может накапливаться путем добавления ингибитора ликопен-цикликазы в процессе ферментации. Несколько исследований показали, что производство ликопена компанией Blakeslea trispora постоянно улучшается, и самый высокий уровень производства ликопена, по сообщениям, составляет 3,4 г/л [18]. Тем не менее, трихотезеновая плесень подвержена дегенерации во время субкультуры, что приводит к нестабильным урожаям. Кроме того, длительный цикл роста делает его менее продуктивным, а необходимость добавления ингибиторов во время производства также значительно ограничивает процесс ферментации ликопена трихотезеновой плесенью [19].

3 исследования по биотехнологическому синтезу ликопена

3.1 инженерная модификация основных микроорганизмов для синтеза ликопена

Escherichia coli является одним из наиболее часто используемых микробных хостов для гетерологического синтеза терпеноидов. Преимущества, такие как четкий генетический фон, быстрый рост клеток и множество инструментов генетических манипуляций, делают E. coli идеальной платформой для разработки промышленной продукции. Некоторые ученые успешно разработали E. coli для гетерологического производства высокопроизводительных каротеноидов на основе метаболической инженерии и синтетической биологии [20-21]. Однако из-за риска подверженности кишечной палочки инфекции фаге и наличия эндотоксинов [22] использование кишечной палочки для производства ликопена в настоящее время создает определенные риски для безопасности пищевых продуктов, и поэтому ее промышленное применение ограничено.

- сачаромицисОбщее состояние здоровья— это эукариотический модельный организм, геном которого был секвенирован, клеточная биология которого была хорошо описана и для которого существуют зрелые инструменты и методы генетических манипуляций. При крупномасштабной ферментации - сачаромицисОбщее состояние здоровьяопасность заражения фагами отсутствует, и, как правило, считается более безопасной, чем Escherichia coli. Поэтому использование метаболической инженерии для преобразования сахаромицидных церебрысий для гетерологического производства ликопена считается перспективным с точки зрения его применения. Как и Escherichia coli, Saccharomyces Общее состояние здоровьяне могут самостоятельно синтезировать каротеноиды и должны вводить соответствующие синтезирующие гены [23-26].

Ярровия липолитика является нетрадиционным микробным хостом, который производит большое количество липидов и считается безопасным. Хотя он не может непосредственно синтезировать каротеноиды, он может производить большое количество прекурсора ацетилкоэнзима а, а синтез каротеноидов может быть достигнут путем введения экзогенных ключевых ферментов. Исследователи разработали множество генетических инструментов для конструирования дрожжей липомицидов, которые считаются перспективным носителем для производства каротеноидов через два [27-28].

Эвкариотические микроводоросли, как автотрофические микроорганизмы, могут использовать световую энергию и двуокись углерода для производства биомассы и поэтому обладают большим метаболическим потенциалом для устойчивого производства терпеноидов. Однако текущие исследования метаболической инженерии высокогорных водорослей значительно отстают от исследований других носителей, что в определенной степени ограничивает их применение [29].

Красные дрожжи Rhodosporidium торулоиды могут производить пигменты, такие как β- каротин и γ- каротин через внутриклеточный биосинтез. Исследователи укрепили его потенциал производства каротеноидов путем оптимизации культурных условий и мутагенеза. Однако в настоящее время исследования по красным дрожжами весьма ограничены, возможно, из-за ограниченности имеющихся геномных данных и отсутствия функциональной аннотации ключевых генов, что в значительной степени препятствует метаболической инженерии высокопроизводительных каротеноидов [30]. Другие некаротеногенные дрожжи, такие как Pichia is, которые могут расти с высокой плотностью без накопления этанола, также были разработаны для синтеза каротеноидов, но урожайность низка и требует изучения [31].

3.2 стратегии синтеза ликопена инженерными микроорганизмами

1. Совершенствование модуля начальной подготовки (поставка прекурсоров IPP/DMAPP)

Для достижения высоких урожаев каротеноидов, таких как ликопен, эффективной стратегией является увеличение синтеза общих прекурсоров IPP и DMAPP. Синтез IPP и DMAPP включает два естественных пути: путь MEP и путь MVA. (a) путь MEP в основном находится в прокариотах. DXС. Sи IDI, как правило, рассматриваются в качестве основных ферментов, ограничивающих цены в этом пути, и были чрезмерно перегружены для повышения изопреноидного синтеза [32]. Li et al. [33] пришли к выводу, что испа, исф и испе еще больше увеличили поток пути в ДКС и иди чрезмерно напряженных штаммах. Чрезмерная уплотнение ispG может эффективно сократить отток мек в ячейке, что приведет к значительному увеличению производства изопреноидов на выходе [34]. Исходя из этого, Li et al. [35] успешно увеличили производство ликопена на 77% путем активации IspG и IspH для устранения накопления промежуточных меп. (b) путь два в основном находится в эукариоте. Редуктаза HMG-CoA — это первый шаг в биосинтезе изосферных соединений через два [36]. Избыток редуктазного каталитического региона HMG-CoA (tHMG1) в Saccharomyces cerevisiae может увеличить производство ликопена [24]. Кроме того, несмотря на определенный прогресс, достигнутый в производстве каротеноидов за счет оптимизации европеоидного пути, регулятивные механизмы естественных хозяев европеоидного пути ограничивают его применение [37]. Для того, чтобы обойти этот путь, чжу файин и др. [20] ввели полный путь MVA и экзогенные гены в Escherichia coli и получили выход ликопена 1,44 г/л путем оптимизации пакетного откорма и ферментации.

(2) Исследования на последующих модулях (гетерологический путь синтеза ликопена). Общая стратегия заключается в Том, чтобы ввести гетерогены путей в некаротеноидные носители для производства каротеноидов, преобразуя прекурсоры синтеза терпенов IPP и DMAPP в каротеноиды. Verwaal et al. [38] выразили плазмиду в E. coli, содержащую гены, кодирующие гираннилгеранилпирофосфат-синтазу и октагидроликопен-синтазу, а также cDNA-кодирование ликопен-десатуразы, и в конечном итоге наблюдали накопление ликопена. Введение копий CrtI и tHMG1 в каротеноидные синтезирующие дрожжевые клетки увеличило содержание гравитационного каротина. Для достижения высокого уровня и генетически стабильного выражения гетерологических генов пути, Tyo et al. [39] создали систему выражения без плазмы, с высокой генной копией для химически индуцированной хромосомной эволюции, которая была использована в инженерии E. coli и в конечном итоге увеличила производство ликопела на 60% по сравнению с системой выражения плазмиды. Исследования показали, что оптимизация пути синтеза ликопена очень важна для гетерологического высокопродуктивного ликопена.

3. Регулировка объездного пути

4. Прекурсор ликопенового синтеза, FPP, также является общим прекурсором многих метаболитов дрожжей (таких, как ubiquinone, terpene спирты, сквален и т.д.). Тем не менее, прямое нокатирование этих генов-прекурсоров конкурентного пути (таких как ген синтеза сквалена) окажет большое влияние на рост клеток. Поэтому многие ученые стремятся к снижению регулирования этих конкурентных путей для увеличения синтетического потока ликопена. Замена слабой промоутер на естественную промоутер для снижения конкурирующей скволеновой синтазы ген sqs1 может увеличить утомительную производительность грава-каротена с (453.9 градиента 20,2) мг/л до (797.1 градиента 57,2) мг/л в Yarrowia lipolytica [40]. Xie Wenping et al. [41] использовали высокую индукцию глюкозы/низкий подавитель глюкозы pHXT1 контроль в Saccharomyces cerevisiae для достижения последовательного выражения генов erg9 и каротеноидных путей в ответ на изменения концентрации глюкозы в культуре, что привело к значительному увеличению производства ликопена в дрожжевых дрожжевых культурах. Hong et al. [42] выбили гены dpp1 и lpp1 из Saccharomyces cerevisiae, чтобы подавить конкурирующие пути для производства фарнесола, и подавили производство эргостерола, занижая выражение erg9, что также увеличило производство ликопена. Вышеуказанные исследования в полной мере продемонстрировали, что ослабление регулирования конкурирующих путей является эффективной стратегией увеличения производства ликопена.

4. Трансформация шасси

Помимо оптимизации гетерологического синтеза ликопена, требуется также преобразование хост-шасси клетки, чтобы соответствовать гетерологическому пути. Модификация шасси включает: увеличение потока прекурсоров ацетилкоа [43], увеличение предложения таких факторов, как атф и надф, вырубку некоторых несущественных генов и адаптивную эволюцию штамма. Ацетил-коа является субстратом для биосинтеза каротеноидов. Чен ян и др. [24] подробно изучили механизм действия гена ypl062w в Saccharomyces cerevisiae. Удаление ypl062w может увеличить поток ацетилкофермента а и в конечном итоге увеличить производство ликопена до 1,65 г/л. Чжоу и др. [26] использовали адаптивную эволюцию Saccharomyces cerevisiae в сочетании с технологиями метаболической инженеры для достижения продуктивности ферментации пакетной подачи 8,15 г/л ликопена. Важным фактором, влияющим на синтез каротеноидов, является подача атф в виде энергии и надф в виде понижающей мощности. Модифицировав центральные метаболические модули для ассимиляции источников углерода (эмп и ППС), было увеличено снабжение СПС и NADPH, и с помощью инженерной E. coli можно синтезировать 2,1 г/л параметрического каротина в пакетной ферментации [44]. Модуляция выражения генов sucAB и sdhABCD может увеличить поток углерода в цикле TCA и увеличить предложение атф. Кроме того, модуляция гена тальба может увеличить предложение надф, что увеличивает выход ликопенового синтеза на E. coli до 3,52 г/л [45].

(5) Систематическая метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства высокопродуктивного ликопена. Резюме показано на рис. 2 и 3.

Ши бин и др. [25] систематически конструировали Saccharomyces cerevisiae для эффективного биосинтезирования ликопена посредством метаболической инженерии и перечислили четыре ключевых вопроса: (а) накопление вторичных метаболитов и рост клеток хоста должны быть сбалансированы; (b) необходимо усилить гетерологический синтез ликопена в дрожжевых составах; (c) дрожжевые шасси должны быть модифицированы, чтобы обеспечить больше веществ-прекурсоров и уменьшить мощность; (d) необходимо оптимизировать технологию ферментации дрожжей. И предложил соответствующие решения, в Том числе: (a) скринирование группы GAL promoters, которые могут разумно контролировать гетерологический синтез ликопенов, отделяя рост дрожжевых клеток от накопления ликопенов продуктов с точки зрения последовательности времени, и прочность promoter также сопоставима с учредительным сильным promoter в период синтеза продукта; (b) комплексное изучение трех основных генных источников гетерологического синтеза ликопена, получение нового оптимального сочетания PaCrtE, PagCrtB и BtCrtI, эффективно функционирующих в Saccharomyces cerevisiae. (c) был также проведен ряд модификаций шасионных клеток Saccharomyces cerevisiae для обеспечения достаточного количества прекурсоров для синтеза ликопена, ацетилкоэнзима а и уменьшения мощности NADPH (сокращенный коэнзим II), а также вырубки некоторых эндогенных несущественных генов, которые влияют на накопление ликопена, в целях дальнейшего увеличения производства ликопена; (d) с помощью этих систем метаболической инженерии методы, в сочетании с преобразованием Saccharomyces cerevisiae процессов ферментации для эффективного биосинтезирования размера ликопена.

Он перечислил четыре ключевых вопроса: (а) необходимо сбалансировать накопление вторичных метаболитов и рост клеток организма; (b) в дрожжах необходимо усилить гетерологический синтез ликопена; (c) дрожжевые шасси должны быть модифицированы, чтобы обеспечить больше веществ-прекурсоров и уменьшить мощность; (d) необходимо оптимизировать технологию ферментации дрожжей. И предложил соответствующие решения, в Том числе: (a) скринирование группы GAL promoters, которые могут разумно контролировать гетерологический синтез ликопенов, отделяя рост дрожжевых клеток от накопления ликопенов продуктов с точки зрения последовательности времени, и прочность promoter также сопоставима с учредительным сильным promoter в период синтеза продукта; (b) комплексное изучение трех основных генных источников гетерологического синтеза ликопена, получение нового оптимального сочетания PaCrtE, PagCrtB и BtCrtI, эффективно функционирующих в Saccharomyces cerevisiae. (c) был также проведен ряд модификаций шашечных клеток Saccharomyces cerevisiae для обеспечения достаточного количества прекурсоров для синтеза ликопена, таких как ацетилкоэнзим а и уменьшение мощности NADPH (сокращенный коэнзим II), а также выведения из организма некоторых эндогенных несущественных генов, которые влияют на накопление ликопена, в целях дальнейшего увеличения производства ликопена; (d) благодаря этим системам метаболические методы инженерии в сочетании с оптимизацией ферментации синтетических сред сахаромициевидными цепочек, выход ликопена достигал 3,28 г/л, который первоначально достиг промышленного уровня. В настоящее время масштабы ферментации в китайском стиле были успешно расширены до 6000 л. кроме того, стратегия метаболической инженерии, разработанная для Saccharomyces cerevisiae, была также успешно расширена до биотехнологического синтеза других соединений терпеня, таких как β-farnesene [46], bergapten [47] и других sesquiterpenes, таких как β-caryophyllene. Среди них Дэн сяомин и др. [47] использовали эту системную инженерную стратегию для повышения урожайности бергаптена, производимой метаболической инженерией штаммов Saccharomyces cerevisiae, до 34,6 г/л.

3.3 процесс ферментации ликопенных бактерий

В настоящее время значительный прогресс достигнут также в исследованиях по ферментации высокопродуктивного ликопена микроорганизмами. Ферментационное сырье, процессы и масштабы, используемые различными штаммами, будут различаться (резюмируется в таблице 1). Субстратная матрица, используемая в процессе ферментации, варьируется в зависимости от типа микроорганизма. Ферментационные хозяев с более зрелым гетерологическим синтезом ликопена, как правило, Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. В целом, ферментация Escherichia coli использует глицерол в качестве источника углерода [20, 45], в то время как Saccharomyces cerevisiae использует главным образом глюкозу в качестве источника углерода [23-26].

Чжу файин и др. [20] использовали глицерол в качестве источника углерода для инженерной эшеричии коли и получили выход ликопена 1,44 г/л, используя полностью синтетическую среду в 5 л ферментера. Впоследствии ферментационная шкала была расширена до 150 л, что дало 1,32 г/л, что указывает на возможность увеличения штамма для производства. Sun et al. [45] использовали инженерную кишечную палочку E. coli для ферментации 7 л с использованием глицерола в качестве источника углерода при кормлении партии и в конечном итоге получили 3,52 г/л ликопена. Чэнь янь и др. [24] использовали инженерные Saccharomyces cerevisiae для ферментации глюкозы и этанола в качестве источников углерода и дрожжевого экстракта, а пептон в качестве источников азота в ферментере емкостью 5 л с использованием метода пакетного откорма.

Они получили ликопеновый титр 1,65 г/л. Ши бин и др. [25] использовали инженерные Saccharomyces cerevisiae для проведения двухэтапной пакетной ферментации 7 л ферментера с использованием глюкозы и этанола в качестве источников углерода и сульфата аммония в качестве источника азота. Остатки глюкозы и этанола в броте ферментации строго контролировались, и был получен окончательный ликопеновый титер в размере 3,28 г/л. Так как Saccharomyces cerevisiae имеет много преимуществ по сравнению с Escherichia coli, таких как высокая безопасность продуктов питания и устойчивость к инфекции фаге, исследования ферментации ликопена Saccharomyces cerevisiae являются более перспективными. В настоящее время природные среды YPD, которые часто используют пептон и дрожжевой экстракт в качестве источников азота для ферментации дрожжей [24, 26], а также полусинтетические среды с сульфатом аммония, дрожжевой экстракт и пептон в качестве смешанных источников азота [23] и полностью синтетические среды с сульфатом аммония в качестве источника азота [25]. Полностью синтетические носители обладают преимуществами дешевизны, простоты многократного брожения и масштабации, а также имеют четкий состав, удобный для последующей оптимизации. В будущем следует провести дополнительные исследования по ферментации синтетических дрожжевых сред, с тем чтобы сделать производство ликопена высоким и стабильным, повторяемым и масштабируемым, закладывая прочную основу для последующего промышленного применения.

3.4 извлечение и количественная оценка ликопена, синтезированного микроорганизмами

Каротиноиды, такие какЛикопен обладает сильными антиоксидантными свойствами, и риск окисления и изомеризации должен быть минимизирован в процессе экстракции [49]. Например, в некоторых исследованиях принято решение работать в условиях световой защиты [20, 45] или добавлять антиоксидантный BHT в экстракционный агент [24-25, 27]. Широко используемыми экстракционными растворителями являются ацетон, нефтяной эфир, хлороформ, гексан, этилацетат и т.д. [49]. Поскольку ликопен является внутриклеточным продуктом, требуется разрушение клеточной стенки, и метод разрушения клеточной стенки варьируется в зависимости от толщины стенки хоста. Например, клеточная стенка Escherichia coli относительно тонкая, ацетонная подвеска обычно используется, за ней следует разрушение клеточной стенки в 55 - гравной водяной ванне [20, 45]; Эвкариотические организмы, такие как липидорастворимые дрожжи и Saccharomyces cerevisiae, имеют более толстые клеточные стенки, а стеклянные бусины и экстракционные реагенты, как правило, добавляются для разрушения клеток путем тряски [25, 27]; Стенки дрожжевых элементов также могут быть сломаны путем кипения в водяной ванне соляной кислотой [23-24].

Методы, используемые для обнаружения и количественной оценки каротеноидов, таких как ликопен, также варьируются в существующих исследованиях. В большинстве исследований используется высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC) для обнаружения каротеноидов, таких как ликопен и грау-каротин [23-26, 45], в то время как в некоторых используется ультрафиолетоспектрофотометрия [20, 27]. Поскольку детекторы ультрафиолетового спектрофотометра подвергаются воздействию примесей с одной и той же длиной абсорбционной волны, а метод HPLC обнаруживает, сначала разделяя различные вещества, а затем обнаруживая абсорбционную величину. Относительно говоря, точная количественная оценка каротеноидов, таких как ликопен, с помощью ГПЛК является более точной, в то время как ультрафиолетовая спектрофотометрическая детекция может использоваться в качестве дополнительного средства для первоначальной оценки тенденции изменения урожайности в процессе ферментации.

В большинстве исследований использовалась стандартная кривая с соответствующими стандартами ликопена и грава-каротина для расчета урожайности [23-26, 45], но не указывалось, были ли калиброваны приобретенные стандарты ликопена/грава-каротина. Лишь несколько исследователей прямо заявили, что концентрация стандартного раствора была калибрована до построения стандартной кривой [25]. Причина, по которой концентрация готового стандартного раствора должна быть калибрована, заключается в Том, что трудно точно взвесить небольшое количество ликопена или грау-каротина стандарта и нелегко точно определить, полностью ли растворены кристаллы ликопена в органическом растворителе. Кроме того, чистота приобретаемого стандарта может также меняться из-за методов хранения и времени. Эти объективные факторы могут привести к большим ошибкам при построении стандартной кривой ликопена, в результате чего расчетная доходность может быть не очень точной. Для устранения влияния вышеуказанных факторов обычно используется спектрофотометр для измерения абсорбации подготовленного ликопена и других стандартных каротеноидов, а затем для расчета абсолютного содержания каротеноидов в растворе по соответствующему коэффициенту вымерения [25, 50-51]. Этот метод позволяет устранить ошибки, вызванные неправильным взвешиванием или неполным растворением образца. Таким образом, HPLC используется для точного обнаружения ликопена в пробе, а стандартная кривая строится с использованием калиброванного стандартного решения, и количественные результаты будут более точными.

4. Выводы и перспективы

Ликопен, как сильный антиоксидант, имеет много хороших физиологических функций и имеет широкую рыночную перспективу. В настоящем документе содержится подробный обзор физико-химических свойств, физиологических функций и методов производства ликопена, а также кратко излагаются результаты текущих исследований в области производства ликопена с помощью биотехнологии, включая широкий выбор микробных хостов, последние стратегии метаболической инженерии, методы ферментации и извлечения ликопена, а также точные методы количественной оценки.

Хотя был достигнут определенный прогресс в биотехнологическом синтезе ликопена, все еще существует много проблем с биосинтезом ликопена, поскольку это сложный проект инженерных исследований со многими влияющими факторами. Ниже кратко излагаются соответствующие направления исследований на будущее:

(1) я Расширение и стабильная репликация ферментационного производства. В настоящее время большинство исследований по биотехнологическому синтезу ликопена все еще находится на лабораторном этапе проведения экспериментов по созданию небольших ферментационных резервуаров, в то время как промышленные исследования часто основываются на крупномасштабном производстве ферментации, рассчитанной в тоннах или десятках тонн. Расширение масштабов ферментации от мелкомасштабного до опытного производства является не просто линейным увеличением объема резервуаров, но также связано со многими проблемами, такими как неравномерная теплопередача, массовая передача и кислородная передача, а также изменения в модели роста штамма. В соответствии с авторством#39. Практический опыт: в процессе ферментации могут возникать такие проблемы, как преждевременное старение штаммов, деформация фенотипа штамма, изменения в стратегиях откорма и неустойчивая ферментация. Исследователям необходимо индивидуально скорректировать параметры и условия усиления процесса ферментации. Будущие исследования по расширению масштабов ферментации производства являются ключом к решению проблемы промышленного производства ликопена с использованием биотехнологии.

(2) процесс извлечения и очистки ликопена из микробных источников. Ликопен является внутриклеточным продуктом, и процесс извлечения и очистки включает в себя многие этапы, такие как нарушение работы клеток, удаление примесей и кристаллизация ликопена. В ходе этого процесса ликопен легко окисляется, что приводит к структурным изменениям. Таким образом, уровень извлечения трудно обеспечить, и необходимы углубленные исследования процесса извлечения и очистки ликопена из микробных источников.

(3) Research on quality testing of На микробной основеlycopene. Although microbial lycopene is also a product of enzymatic catalysis, it is not derived from natural tomatoes and may involve issues such as genetic modification. Therefore, microbial lycopene must first be structurally identified to ensure that it is consistent with natural tomato sources, and then quality testing of product quality such as heavy metal residues and microbial content is required. Ensuring the structure and quality of the product is also an important factor affecting the market application of microbial lycopene.

(4) Production cost control: If it is to compete in the market with naturally extracted lycopene, biotechnologically synthesized lycopene must have a significant cost advantage. The main costs of biologically fermenting to produce lycopene include 3. Ферментацияraw materials, depreciation of equipment, extraction and purification, labor, and marketing. Cost factors must be considered when designing and optimizing production В рамках процессаconditions, such as using cheaper fully synthetic fermentation media, spreading costs by scaling up fermentation, and using more advanced methods such as enzymatic cell disruption to extract lycopene to reduce production costs.

Решение этих проблем имеет большое теоретическое и практическое значение для содействия индустриализации производства ликопена с помощью биотехнологии, а также может служить отправной точкой для исследований по биотехнологическому производству других натуральных продуктов с высокой добавленной стоимостью.

Ссылки на статьи

[1] защитное воздействие мк -4 на окисление градиеноидов карота в имитированном желудочном соке [J]. Журнал Huazhong Agri⁃ cultural Университет,2020,39(2): 102 — 111(in Китайский язык (english) С резюме на английском языке.

[2] лю К 'кей, лю X Y, ван Q,et Al. Оптимизация Ii. Основные направления деятельности - ингредиент Соотношение между мужчинами и женщинами of  На территории комплекса Фрукты и фрукты and  - овощные продукты Вино, богатое ликопеном по d-оптимальной конструкции смеси [J]. Китай brew⁃ ing,2022,41(2):164-169

[3] ZARDINI A A,MOHEBBI M,FARHOOSH R,et al and  3. Определение характеристик of  Структура наноструктуры - липид. Носители и твердые липидные наночастицы, содержащие ликопен для пищевых продуктов fortifi⁃ cation[J]. Журнал по теме В области продовольствия Наука и техника and  Технологии,2018,55 (1):287 — 298.

[4] LEE С. О.T,CHEN B H. стабильность ликопена во время нагрева И освещенность в модельной системе [J]. Пищевая химия,2002, 78(4):425 — 432.

[5]WANG X W,XIA Y B,WANG К. К.Q.Stability of natural lycopene[J]. Журнал хунанского сельскохозяйственного университета,2002,28(1):57-60 (на китайском языке с аннотацией на английском языке).

[6]MA T g.физиологические функции и применение Из ликопена [J]. Зерновые и прочие продукты Масла,2008,21(1):46-48(в тиграх. Nese с резюме на английском языке.

[7]LI J,YAN W,LIU Y H,et al. Research progress on health function and application of lycopene[J]. Сельское хозяйство и технологии,2016,36(15):5-6 (на китайском языке).

[8]JIANG L H,LIU H F,HAO G F, и др. научно-исследовательский прогресс по антиоксидантной способности Astaxanthin [J]. Наука и технологии пищевой промышленности,2019, 40(10):350 — 354.

[9]PENG Y J, LU H P, WANG S N, и др. настоящее исследование и перспективы в области природных ресурсов Astaxanthin [J]. Китай (Китай) - продукты питания Присадки,2017(4): 193 — 197.

[10] ASSAR E A,VIDALLE M C,CHOPRA M, и др. ликопен действует через ингибирование IκB kinase, чтобы подавить NF-κB сигнал ⁃ ing в клетках простаты и рака молочной железы [J]. Опухоли biolo⁃ gy,2016,37(7):937 -9385.

[11] рао A  - ви, агарвал S. роль организации - антиоксидант lycopene  При раке и болезни сердца [J]. Журнал американского колледжа питания,2000,19(5):563-569.

[12]HUO S X,YANG Q S,YUE X H,et al.Determination method of lycopene content В томатной коже [J]. Пищевая промышленность,2019,40(6):263-265 (на китайском языке с резюме на английском языке).

[13] KARL M.Method дляthe manufacture of carotinoids and novel ates:US5208381[P].1993-05-04.

[14] KIRBY J,KEASLING - J.D.Biosynthesis of plant isoprenoids: перспективы для microbial  Машиностроение [J]. Годовой отчет о проделанной работе Ii. Обзор of  Биология растений,2009,60:335-355.

[15] ROHMER M,KNANI M,SIMONIN P, и др to  Isopentenyl diфосфат [J]. В настоящее время Биохимический журнал, 1993,295(Pt 2):517-524.

[16] BLOCH K,CHAYKIN S,PHILLIPS A H,et al. Журнал биологической химии,1959,234(10):2595-2604.

[17] шудхари S  М, ананатанараян Я буду петь. HAL R S. использование метаболических стимуляторов и ингибиторов для en⁃ Производство грау-каротина и ликопена компанией Blakeslea tri β Spora NRRL 2895 и 2896[J]. Технология биоресурсов,2008, 99(8):3166-3173.

[18] анатес т м р, де кастротес а е, перец J  C. повышение эффективности method  of  producing  Ликопен, подготовка для Получение дополнительной информации Ликопен, и application  Из них: CN1617934A[P].2005-05-18.

[19] WANG J F,LIU X J,LIU R S, и др. оптимизация мат ⁃ ed  fermentation  process  for  the  production  of  lycopene  by  Blakeslea trispora NRRL 2895(+) и NRRL 2896 (по запросу) [J]. 1. Биопроцесс and  Iv. Биосистемы Инжиниринг,2012,35(4): 553 — 564.

[20] ZHU F Y,LU L,FU S,et al.target Инженерное дело иscale of lycopene Избыточное производствоin Escherichia coli[J]. Биохимия процессов,2015,50(3):341 — 346.

[21] PARК. К.S Y,BINKLEY R M,KIM W J,et al.⁃ ic engi Ниринг Escherichia coli для высокого уровня astaxanthin produc⁃ Высокая производительность [J]. 3. Метаболизм Машиностроение,2018, 49:105-115.

[22] RAY B L,RAETZ C R. биосинтез грам-отрицательный эндотоксин#39;- фосфат липидов A[J]. Journal of biologi⁃ cal chemistry,1987,262(3):1122-1128.

[23] XIE W P,LV X M,YE L D,et al. Инженер-метаболист,2015,30:69-78.

[24] CHEN Y,XIAO W H,WANG Y,et al.Lycopene overproduc⁃ tion in Saccharomyces cerevisiae through Сочетание проходной инженерии с принимающей инженерией [J/OL]. Фактические микробные клетки,2016,15(1):113[2023-03-13]. https://microbialcellfac⁃.    Биометрический центр.    Com/статьи/10.1186/s12934 -016- 0509-4.

[25] ши б, ма т, е з л и др. системная метаболическая инженерия - из сакчаромицин cerevisiae  for  lycopene  overproduction  [J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,2019,67(40): 11148-11157.

[26] чжоу К, ю C, лян (Китай) N,et, Al. Адаптивная система Iii. Эволюция И метаболическая инженерия повышает производство ликопена в Saccharo⁃ myces cerevisiae за счет увеличения предложения и использования прекурсоров [J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,2023,71(8): 3821-3831.

[27] GAO S L,TONG Y Y,ZHU L,et al. Итеративная интеграция Многократная копия генов пути в Yarrowia lipolytica для heter⁃ - по логике - о, каротин Производство [J]. 3. Метаболизм Машиностроение, 2017,41:192-201.

[28] LARROUDE M,CELINSKA E,BACK A, и др. синтетический биологический подход к преобразованию Ярровия липолитика в com⁃ petitive биотехнологический производитель β-carotene[J]. Биотехнол и биоинженерия,2018,115(2):464 — 472.

[29] GUERIN M,HUNTLEY M E,OLAIZOLA M.Haematococ⁃ cus astaxanthin:applications for human health and nutrition[J]. Тенденции в области биотехнологии,2003 год,21(5):210-216.

[30] диас с, силва с, фрейтас с, и др. влияние среднего pH на родоспоридиум торулоиды NCYC 921 каротеноид и губ ⁃ id production  Оценка была проведена by  По направлению движения Цитометрия [J]. Применение на практике Биохимия и биотехнология,2016,179(5):776-787.

[31] BHATAYA A,SCHMIDT-DANNERT C,LEE P C. Meta⁃ bolic engineering of Pichia ⁃ is X-33 for lycopene produc tion[J]. Биохимия процессов,2009,44(10):1095 — 1102.

[32] YANG J M,GUO L Z. Biosynthesis О-каротин в Engi ⁃ neered E.coli используя пути MEP и MVA [J]. Microbi⁃ al cell factory,2014,13:160.

[33] LI Y F,LIN Z Q,HUANG C,et al.⁃ ic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 ated genome edit ing[J]. Метаболическая инженерия,2015,31:13-21.

[34] чжоу к, цзоу р и, стефанопулос г, и др. метаб ⁃ olite профилирование Идентифицирован метилеритритол - циклодифосфат Ef ⁃ flux как ограничивающий шаг в производстве микробного изопреноида [J]. График 1,2012,7(11):e47513.

[35] LI Q Y,FAN F Y,GAO X,et al.⁃ activation of IspG and IspH to MEP intermediate аккумуляции и im isoprenoids production in Escherichia coli[J]. Метаболическая инженерия,2017,44:13-21.

[36] димстер-денк - ди, терзание M  K, рин (RINE) J. регулирование обратной связи между 3- гидроксией -3- метилглутарилкоферзимом A re⁃ ductase в Saccharomyces cerevisiae[J]. Молекулярная биология клетки,1994,5(6):655 — 665.

[37] MARTIN V J J,PITERA D J,WITHERS S T,et al. Engi⁃ Ниртинг мевалонатный путь в эшерихия коли для профилактики tion  of  Терпеноиды [J]. Природа и природа Биотехнология,2003,21(7): 796-802.

[38] VERWAAL R,WANG J,MEIJNEN J P,et Производство на высоком уровне of  beta-carotene  in  Saccharomyces  cerevisiae  Путем последовательного преобразования с каротеногенными генами из Xan⁃ thophyllomyces Dendrorhous [J]. Применение на практике and  Экологическая микробиология,2007,73(13):4342-4350.

[39] TYO K E J,AJIKUMAR P K,STEPHANOPOULOS G. стабилизация обстановки - генная инженерия B. дублирование усилий Для этого необходимо: На долгосрочную перспективу Свободный выбор гетерологичен Путь к успеху Выражение [J]. Природа и природа Биотехнология, 2009,27(8):760-765.

[40] килдегард K  Р, адиго-перез B, DOMENECH BELDA D,et al. Инжиниринг Yarrowia lipolytica для pro⁃ duction of astaxanthin[J]. Biotechnolo ⁃ gy,2017,2(4):287 — 294.

[41] XIE W P,YE L D, LU X M,et al.sequциальный контроль биосинтетических путей сбалансированного использования метаболических inter⁃ mediates в Saccharomyces cerevisiae[J]. Метаболический инженер грауинг,2015,28:8-18.

[42] HONG J,PARK S H,KIM S и др. эффективное производство ликопена in  Saccharomyces  cerevisiae  by  1. Фермент engineering and  Увеличение объема мембраны 3. Гибкость Производства и НПДХ [J]. Прикладная микробиология и биотехнология,2019,103(1): 211 — 223.

[43]LI J R,LIN J Y,LI Z Y,et al.Mining and ⁃ tic acid стресс -responsivegenes to improve lycopene syn Диссертация по рекомбинату Saccharomyces cerevisiae[J/OL]. 1. Микро-графы 1. Биология Китай,2023:1-24[2023-03-13].

[44] жао джей, ли Q Y,SUN T,et al.Engineering центральные метаболические модули Escherichia coli для улучшения β -carotene produc⁃ tion[J]. Метаболическая инженерия,2013,17:42-50.

[45] SUN T,MIAO L T,LI Q Y, и др Escherichia  Coli [J]. Биотехнологические письма,2014,36(7):1515-1522.

[46] YE Z L,SHI B,HUANG Y L,et al.Revolution of vitamin E production from microbial fernesene to isophytol[J/OL]. Нововведение,2022,3(3):100228[2023- 03-13].https://doi.org/10.1016/j.xinn.2022.100228.

[47] DENG X M,SHI B,YE Z L,et al.− identification Ocimum sanctum sesquiterpenoid synthases and () -eremophilene overproduction in engineered yeast[J]. Метаболический энджи,2022,69:122-133.

[48] LUO Z S,LIU N,LAZAR Z,et al.⁃ isoprenoid syn thesis в Yarrowia lipolytica путем выражения использования isopentenol Путь к успеху and  3. Модуляция 5. Внутриклеточные мышцы Гидрофобия [J]. Метаболическая инженерия,2020,61:344-351.

[49] CHOKSI P M,JOSHI V Y.A review on lycopene: экстракция, очистка, стабильность и применение [J]. < < международный журнал > > Пищевых свойств,2007,10(2):289-298.

[50] платформы BIAN G K,MA T,LIU T G.In vivo для перепроизводства терпеноидов and  the  Организация < < поколение > > of  chemical  Разнообразие [J]. Методы в энзимологии,2018,608:97-129.

[51] Скотт K  J. выявление нарушений and  3. Измерение of  - каротеноиды Спектрофотометрия уф/вис [J]. Текущие протоколы в пищевой промышленности ана паралитическая химия,2001,F2.2(1):1-10.