Исследование по синтезу женьшеня

Женьшень (Panax женьшень c.a. Mey), принадлежащий к роду Panax в семье Araliaceae, является широко известным лекарственным растением, распространённым главным образом в северо-восточном китае, корее и японии. Женьшень содержит различные химические компоненты, такие как сапонины, полисахариды, полиацетилен и флавоноиды. Среди них женьшень является вторичным метаболитом женьшеня и его основным биоактивным компонентом. Она имеет широкий спектр физиологических и фармакологических мероприятий, включая регулирование иммунной системы, антистрессовые, гипогликемические, противовоспалительные, антиоксидантные и противораковые эффекты. Его механизм действий заключается главным образом в мобилизации кузова и#39. Внутренние факторы, мобилизуют нейрозащитные механизмы и иммунные механизмы для осуществления их воздействия, практически без токсичности или побочных реакций.

Женьшень в настоящее время является одним из world's бестселлер традиционной китайской медицины и широко используется во всем мире. Общий объем мирового рынка потребления женьшеня и сопутствующих продуктов оценивается в 350 миллионов долларов США [1]. Однако выращивание женьшеня является очень трудным делом из-за длительного периода обработки (6-7 лет до зрелости) и серьезных заболеваний растений, таких как болезни красной кожи и корневая гниль [1]. Поэтому исследователи изучили ткани и клеточные культуры женьшеня, такие как каллюс ткани и суспензии клеток, чтобы стимулировать образование корней в нормальных корнях с помощью Agrobacterium tumefaciens, который, в свою очередь, производит женьшень. Однако эффективность производства женьшеня с помощью этого метода очень низкая. Таким образом, метаболическая инженерия используется для перепроизводства женьшень [2-3], что является привлекательной стратегией для повышения эффективности производства женьшень.

1 обзор женьшеня

Основным фармакологическим активным ингредиентом женьшеня являетсяЖеньшень (женьшень), который является тритерпене сапонин. Женьшень называют RX (X = 0, a -1, a -2, B-1, B-2, B-3, C, D, E, F, 20-O-F, G-1, G-2, H-1, ⅆ, X) в соответствии с порядком их Rf значений от нижней до верхней на TLC пластине [4]. Женьшень производные сахара, в основном соединения, в которых гидроксильная группа сахара связана с несахарной благочестия. Несахарное благочестие называется агликоне. Женьшень подразделяется на две группы на основе структуры aglycone: dammarane тип и олаанан тип. Тип dammarane является основным типом, а его основной скелет является тетрациклическим циклом. В соответствии с позицией сахарных групп на углероде 3, 6 и 20, которые могут быть пустыми или прикреплены к сахарному кольцу, женьшень может быть далее разделена на протоженьшень и протоженьшень. Только Один женьшень женьшень, Ro, является женьшень олаананового типа, с олеанолиевой кислотой, как агликоне и пентациклический основной скелет.

В настоящее время женьшень, как было подтверждено, состоит из более чем 100 женьшень, и более 40 женьшень были изолированы, большинство из которых являются damarane- тип, в Том числе новые женьшень недавно изолированы от женьшень почки, обработанные женьшень, и женьшень листья. Среди них наиболее широко изученными и примечательными женьшень являются Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Rg2, Rg3, Re, Rf, Rh1 и Rh2 [6]. Биологическая деятельность недавно обнаруженного женьшеня все еще нуждается в изучении.

2 биосинтез женьшеня

В растениях существуют два пути биосинтеза терпене, а именно путь MVA и путь 2- c-метил-d-эритритол -4- фосфат (MEP). Ранее считалось, что женьшень синтезируется через мевалонатную тропу (MVA-тропу) для синтеза IPP и DMAPP, а затем 2,3- оксокаурена, который дополнительно модифицируется гидроксилацией и гликозилацией, с тем чтобы в конечном итоге получить различные мономеры женьшеня. Недавние исследования показали, что растения могут также использовать гликолитические промежуточные продукты пирувата и 3- фосфоглицерат в качестве прекурсоров для производства меп через ферзиматические действия и, в конечном счете, ПМП и дмапп. Эйзен-вайч и др. использовали изотопный индикатор C13 для изучения биосинтезионного пути антиканцера terpene paclitaxel, и результаты показали, что paclitaxel в основном синтезируется по пути MEP [7]. Женьшень также терпеноиды, но нет никаких сообщений о Том, существует ли путь MEP в женьшень.

На растениях путь два присутствует в цитоплазме, в то время как путь MEP — в пластидах [8]. Они разделены, но процессы реакции осуществляются одновременно. Хотя эти два пути существуют в двух разных сотовых пространствах, оба они генерируют IPP. Существует ли обмен IPP между двумя путями и детали обмена всегда были одной из горячих тем в исследовании terpene метаболизма растений. Исследователи использовали ингибиторы ключевых ферментов для ингибирования путей MVA и MEP по отдельности, подтверждая, что эти два пути в значительной степени независимы друг от друга, а также обнаруживая, что обмен IPP между этими двумя путями происходит [9-10]. Поэтому в определенной степени синтез пис этих двух путей имеет компенсационную функцию, которая также может быть одной из причин того, почему ранее не был обнаружен путь пэ в растениях. Однако до сих пор не было проведено никаких исследований по вопросу о методе экстракции женьшеня. Кроме того, еще предстоит изучить вопрос о Том, играют ли оба пути или только Один из них важную роль в синтезе женьшеня.

В женьшень биосинтические пути стероидов и тритерпеноидов имеют Один и тот же прекурсор, 2,3- оксидосвален, а этапы циклизации в форме 2,3- оксидосвален и разветвления одинаковы в обоих направлениях. В женьшене синтез фитостеролов и тритерпеноидов начинается с продукта 2,3- окислительной циклизации, катализируемой окислительной цикликой (окс). В женьшень, β-amyrВ случае необходимостиsynthase (β-AS), dammarane synthase (DS) и cycloartanene synthase (CS) относятся к семейству оксидоскуленов cyclase (OSC) и расположены в точке разветвляемости биосинтеза тритерпеноидов и стеролов (рис. 1). Кас катализирует образование циклоартанола, может быть использована в качестве прекурсора для растений стеролов. DS и β- как прекурсоры женьшеня, с DS обеспечивая тетрациклический dammarane скелет для синтеза женьшеня типа dammarane и β- как обеспечивая тетрациклический скелет для синтеза женьшеня типа оланань. Полуфабрикаты dammarane и β-boswellic acid могут быть преобразованы в женьшень через серию гидроксилирующих и гликозилирующих реакций [11-13]. Цитохром P450, как полагают, участвуют в гидроксилировании женьшеня скелета [14], в то время как гликозилтрансферазы участвуют в гликозилации женьшеня скелета [14].

3 клонирование и исследования генов кодирования ферментов, участвующих в биосинтезе женьшенозида

Ли и др. [15] выделили полный клон cDNA SS (PgSS1, номер присоединения: AB115496) путем EST анализа библиотек cDNA листа женьшеня. PgSS1 считается мультикопированным геном или геном с несколькими внутренними соединениями. Чрезмерная уплотнение PgSS1 повысила активность фермента PgSS1, что привело к значительному увеличению содержания растительного стерола и женьшеня. Эти результаты показывают, что PgSS1 является не только ключевым нормативным ферментом в фитостерол биосинтеза, но и в женьшеносиде биосинтеза. Те же результаты были также обнаружены в гетерологических чрезмерных уплотнениях женьшеня Panax PgSS1 [16], в которых уровни фитостеролов (B-sitosterol, stigmasterol) и тритерпене сапонинов увеличились в 2,0-2,5 раза в трансгенном женьшене Panax. Кроме того, это говорит о Том, что в других растений гетерологический избыточный уплотнение генов, участвующих в биосинтезе женьшеня triterpene saponin, может использоваться для повышения уровня женьшеня и разъяснения механизма биосинтеза женьшеня.

Кусиро и др. [12] выделили два различных гомологических клона cDNA, кодирующих β-AS synthase (PNY1 и PNY2) от корень женьшеня. Эти два шага могут иметь общего предка, который развивался через несколько копий и мутаций во время эволюции. Определена ключевая внутренняя часть фермента, образующего β-asarone (PNY1). Кроме того, в ходе проведенного под руководством сайта исследования мутации PNY1 был выявлен единственный аминокислотный остаток Tyr261, который имеет решающее значение для конкретности продукта. У-амирин и его метаболиты часто зависят от тканей [17], что может быть причиной только Один тип олаанан-тип сапонин (Ro) был идентифицирован женьшень.

Dammarane synthase (DS) считается наиболее важным биосинтическим ферментом женьшеня. Под его каталитическим действием 2,3- окислитель-квален преобразуется в (20с)- даммаран, а не (20р)- даммаран. В последнее время исследователи используют технологию рт-ПЦР для клонирования синтазы dammarane-II [18]. Этот DS содержит 2310 бп ORF, кодирующий полипептид 770 аминокислот, и прогнозируемая молекулярная масса этого полипептида составляет 88,3 кда. Кроме того, вмешательство РНК DS в трансгенный женьшень может заставить замолчать выражение DS, что приведет к 84,5% сокращению производства сапонина у корней женьшеня [19]. Эти результаты показывают, что DS является ключевым ферментом, участвующим в биосинтезе женьшеня, и поэтому чрезмерная сжатие DS может значительно повысить биосинтез женьшеня.

До сих пор изучались только сс, дс, ав и с. В женьшень был определен ген (номер присоединения AB009031), кодирующий производство протоанакриола женьшеня [20], что говорит о новом пути синтеза стерина в женьшень. Кроме того, результаты анализа тегов экспрессии последовательности (EST) cDNA библиотек из различных тканей женьшеня [5, 14, 21] показали, что потенциальные гены, связанные с женьшеньозид биосинтеза кодирования женьшеня ферменты, такие как HMGR, FRS, geranylgeranyl дифосфата synthase, цитохром P450, гликозилтрансферазы, β-glucosidase и lupeol synthase (LUS).

Перспективы на будущее

Среди различных химических компонентов женьшеня, женьшень являются его основными активными ингредиентами. В настоящее время большинство исследований сосредоточено на компонентах сапонина. До того, как путь MEP был обнаружен в бактериях и растениях, путь MVA считался единственным синтетическим путем синтеза тритерпеноидов сапонинов из IPP и DMAPP. В настоящее время доказано, что путь европ существует в различных растениях; Вместе с тем необходимо провести дополнительные исследования по вопросу о методе реализации европроекта в женьшене.

Молекулярная биология и методы энзимологии были эффективно использованы для выявления механизма биосинтеза женьшеня, и все больше и больше полных cDNA последовательности генов и потенциальных генов кодирования ферментов, связанных с биосинтезом женьшеня были получены. Кроме того, эбт широко используется для клонирования генов и выражения синтазы сквалена (HMGR, FPS, farnesyl diфосфат synthase, SE), необходимой для синтеза женьшеня и ферментов, требуемых на последующих этапах (цитохром P450, гликозилтрансферазы, b-глюкозидазы). Кроме того, открытие гена-кандидата для синтеза люпела и ланостерола в женьшене улучшило понимание метаболических путей в женьшене. Традиционно корни женьшеня считаются основной тканью для биосинтеза женьшеня. Однако DS, ответственные за большинство биосинтеза женьшеня, выражены на самом высоком уровне в цветочных почках женьшеня [19]. Это говорит о Том, что женьшень цветочные почки могут быть идеальным материалом для дальнейшего сечения биосинтеза женьшень путь.

До сих пор основными методами, используемыми для идентификации генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе женьшеня, были рт-ПЦР [12-13] и EST анализ [5, 14, 21]. Создана бактериальная искусственная хромосомная библиотека женьшеня, основанная на геномике женьшеня. Эти ресурсы могут использоваться не только для выявления генов, связанных с женьшенем, но и для разъяснения механизмов регулирования экспрессии генов. В последние годы RNAi стал очень эффективным техническим средством в метаболической инженерии растений. Он может эффективно препятствовать выражению конкретных генов и может использоваться в качестве инструмента для будущего обнаружения генов, участвующих в регулировании обмена женьшеня и функциональной проверки. Использование технологии RNAi позволяет анализировать гены, связанные с синтезом женьшеня, в больших масштабах и с высокой эффективностью, а также более эффективно и точно выявлять возможные метаболические регулятивные гены и проверять их функцию [22]. В настоящее время, несмотря на значительный прогресс в выявлении путей синтеза женьшеня, исследования каталитического уровня соответствующих ферментов еще не проводились. Кроме того, последующие шаги биосинтеза женьшеня все еще нуждаются в уточнении, и еще предстоит пройти долгий путь для анализа биосинтеза женьшеня.

Женьшень сапонин является важным компонентом вторичных метаболитов, и их содержание и состав определяются главным образом ключевыми ферментами в биосинтезе и уровнями их выражения в клетках. Метаболизм растительных стеролов и тритерпеноидов является весьма сложным и динамичным процессом, который регулируется многочисленными факторами. Есть еще много вопросов, на которые необходимо ответить, прежде чем метаболический путь женьшеня может быть полностью прояснен. Однако, учитывая экономическую и фармакологическую важность женьшеня, это все еще важная область, над которой стоит работать.

Ссылка:

[1]HONG S G,LEE K H,KWAK J, и др. разнообразие дрожжей, связанных с Panax женьшень [J]. Журнал микробиологии,2006,44: 674-679.

[2] У цон, чжоу юньцюнь, сунь чао и др. Биосинтез женьшенозида и технология вторичного метаболизма [J]. Китайский журнал биологической инженерии, 2009, 29(10): 102-108.

[3] лян и чжао с. Прогресс в понимании биосинтеза женьшеня [J]. Биология растений,2008,10:415-421.

[4]OKAZAKI H, taзои F,OKAZAKI S, и др. Журнал липидных исследований,2006,47: 1950-1958.

[5]KIM M K,LEE B S,IN J G,et al.Comparative 3. АнализСоединенные Штаты америкиБывшая югославская республика македонияse- quence tags (эбт)  Соединенные Штаты америки Женьшень лист [J]. На территории предприятия 1. Ячейка Республика,2006,25: 599 -606.

[6]HELMS S. Профилактика рака и лечение: Panax женьшень [J]. Alterna- tive Medicine Review,2004,9: 259-274.

[7] эйзенвайч W, менхард B,HYLANDST P J, и др. исследования по би-осинтезе таксола: таксановый углеродный скелет не имеет мевалоноидного происхождения [J]. Биохимия,1996,93: 6431 — 6436.

[8]SEEMANN M,TSE SUM BUI B,WOLFF M, и др. FEBS письма,2006,580: 1547 - 1552.

[9] хеммерлин а, хэффлер джей ф, мейер о и др. перекрестный разговор между ними Цитозолический мевалонат и плазтидиальные метилеритритолофосфатные пути В табаке ярко желтые 2 клетки [J]. Журнал биологической химии,2003,278: 26666-26676.

[10]ROHDICH F,ZEPECK F,ADAM P, и др. Труды ан США,2003,100: 1586-1591.

[11] кусиро т, оно и, шибуя м, и др. in vitro преобразование 2,3 - оксидоскалена в dammarenediol Panax женьшень микросомы [J]. Биологический и фармацевтический бюллетень,1997,20: 292-294.

[12] кусиро т, сибуя м, эбзука и. Бета-амирин синтаза: клонирование оксидоскаленовой циклозы, которая катализирует формирование наиболее популярного тритерпена среди высших растений [J]. Eur J Biochem,1998,256: 238-244.

[13] кусиро - ти, шибуя  - привет, эбизука - Y. 10. Молекулярная структура  1. Клонирование Соединенные Штаты америки Окс-ido- сквален.cyclase cDNA от Panax женьшень: изоген, который кодирует - бетаамирин - синтакэйз. На пути к миру По окружающей среде В области медицины Объединенных наций в области 21 - е заседание Век [J]. Выдержка из "медика интернешнл" Конгресс организации объединенных наций Серия,1998,1157: 421-428.

[14]JUNG J D,HAHM Y,HUR C G, и др analysis  Женьшень (женьшень) exp ressed  1. Последовательность действий Теги [J]. Заводская клеточная Rep,2003,22: 224-230.

[15]LEE M H,JEONG J H,SEO J W,et al.Enhanced triterpene иphytos- terol 2. Биосинтез in  Женьшень панакс  Чрезмерная нагрузка на персонал  squalene  Synthase джин [J]. Физиология растительных клеток,2004,45 (8) : : 976-984.

[16]SEO J W,JEONG J H,SHIN C G,et al.overpression squalene syn- thase in - элеутероккус «Сентикоз» (senticosus) Увеличение объема ресурсов Фитостерол (фитостерин) and  Накопление тритерпенов [J]. Химия,2005,66: 869 — 877.

[17]PHILLIPS D R,RASBERY J M,BARTEL B,et al.Biosynthetic diversity При циклизации растений [J]. Современное мнение в области биологии растений,2006, 9: 305-314.

[18] пимпимон тансакул м с, тецуо кусиро, ютака эмидзука. Dammarenediol-II synthase, первый специализированный фермент для женьшень bi- osynthesis, в Panax женьшень [J]. FEBS письма,2006,580: 5143-5149.

[19]HAN J Y,KWON Y S,YANG D C,et al.Expression и RNA interfer- ence- индуцированное силой глушение of  В настоящее время Dammarenediol synthase ген в Panax женьшень [J]. Физиология растительных клеток,2006,47 (12) : 1653 — 1662.

[20]SUZUKI M,XIANG T,OHYAMA K,et al.Lanosterol synthase indicotyle- donous растения [J]. Физиология растений и клеток,2006,47: 565-571.

[21]CHOI D W,JUNG J,HA Y I,et al.Analysis of transin метилjas manat-обработанный женьшень волосатые корни для выявления генов, участвующих в био-синтезе женьшеноидов и других Вторичные метаболиты [J]. На территории предприятия 1. Ячейка Республика,2005,23: 557 — 566.

[22] Пан сичун, сан мин, чжан лей и др. RNA интерференция и ее применение в метаболической инженерии лекарственных растений [J]. Китайская травяная медицина, 2005, 36(9): 1281-1284.