Исследование по синтезу женьшеня

Женьшень (Panax женьшень c- да.a. Mey), принадлежащий к роду Panax в семье Araliaceae, является широко известным лекарственным растением, распространённым главным образом в северо-восточном китае, корее и японии. Женьшень содержит различные химические компоненты, такие как сапонины, полисахариды, полиацетилен и флавоноиды. Среди них женьшень является вторичным метаболитом женьшеня и его основным биоактивным компонентом. Она имеет широкий спектр физиологических и фармакологических мероприятий, включая регулирование иммунной системы, антистрессовые, гипогликемические, противовоспалительные, антиоксидантные и противораковые эффекты. Его механизм действий заключается главным образом в мобилизации кузова и#39. Внутренние факторы, мобилизуют нейрозащитные механизмы и иммунные механизмы для осуществления их воздействия, практически без токсичности или побочных реакций.

Женьшень в настоящее время является одним из world's бестселлер традиционной китайской медицины и широко используется во всем мире. Общий объем мирового рынкаПотребление женьшеняИ связанные с этим продукты, по оценкам, достигли 350 миллионов долларов США [1]. Однако выращивание женьшеня является очень трудным делом из-за длительного периода обработки (6-7 лет до зрелости) и серьезных заболеваний растений, таких как болезни красной кожи и корневая гниль [1]. Поэтому исследователи изучили ткани и клеточные культуры женьшеня, такие как каллюс ткани и суспензии клеток, чтобы стимулировать образование корней в нормальных корнях с помощью Agrobacterium tumefaciens, который, в свою очередь, производит женьшень. Однако эффективность производства женьшеня с помощью этого метода очень низкая. Таким образом, метаболическая инженерия используется для перепроизводства женьшень [2-3], что является привлекательной стратегией для повышения эффективности производства женьшень.

1 обзор женьшеня

The maВ случае необходимостиpharmacological active ingredient Соединенные Штаты америкиginseng is ginsenoside, which is a triterpene saponin. Ginsenosides are named RX (X = 0, A-1, A-2, B-1, B-2, B-3, C, D, E, F, 20-O-F, G-1, G-2, H-1, ⅆ, X) according to В настоящее времяorder Соединенные Штаты америкиtheir Rf values from bottom to top on a TLC plate [4]. Ginsenosides are derivatives Соединенные Штаты америкиsugars, mainly compounds in which the hydroxyl group of a sugar is bound to a non-sugar moiety. The non-sugar moiety is called the aglycone. Ginsenosides are divided into two groups based on the structure of the aglycone: the dammarane type иthe oleanane type. The dammarane type is the main type, and its basic skeleton is a tetracycle. According to the position of the sugar groups on carbons 3, 6 and 20, which can be empty or attached to the sugar ring, ginsenosides can be further divided into protoginsenol and protoginsenol. Only one ginsenoside, Ro, is an oleanane-type ginsenoside, with oleanolic acid as the aglycone and a pentacyclic basic skeleton.

At present, ginsenosides have been confirmed to be composed of more than 100 ginsenosides, и более 40 женьшень были изолированы, большинство из которых являются damarane- типа, в Том числе новые женьшень недавно изолированы от женьшень почки, обработанные женьшень, и женьшень листья. Среди них наиболее широко изученными и примечательными женьшень являются Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Rg2, Rg3, Re, Rf, Rh1 и Rh2 [6]. Биологическая деятельность недавно обнаруженного женьшеня все еще нуждается в изучении.

2 биосинтез женьшеня

В растениях существуют два пути биосинтеза терпене, а именно путь MVA и путь 2- c-метил-d-эритритол -4- фосфат (MEP). Ранее считалось, что женьшень синтезируется через мевалонатную тропу (MVA-тропу) для синтеза IPP и DMAPP, а затем 2,3- оксокаурена, который дополнительно модифицируется гидроксилацией и гликозилацией, с тем чтобы в конечном итоге получить различные мономеры женьшеня. Недавние исследования показали, что растения могут также использовать гликолитические промежуточные продукты пирувата и 3- фосфоглицерат в качестве прекурсоров для производства меп через ферзиматические действия и, в конечном счете, ПМП и дмапп. Эйзен-вайч и др. использовали изотопный индикатор C13 для изучения биосинтезионного пути антиканцера terpene paclitaxel, и результаты показали, что paclitaxel в основном синтезируется по пути MEP [7]. Женьшень также терпеноиды, но нет никаких сообщений о Том, существует ли путь MEP в женьшень.

In plants, the MVA pathway is found to exist in the cytoplasm, while the MEP pathway is found in the plastids [8]. They are separated, but the reaction processes are carried out simultaneously. Although these two pathways exist in two different cellular spaces, they both generate IPP. Whether there is an exchange of IPP between the two pathways and the details of the exchange have always been one of the hot topics in the study of terpene metabolism in plants. Researchers have used inhibitors of key enzymes to inhibit the MVA and MEP pathways separately, confirming that the two pathways are largely independent of each other, while also finding that IPP exchange between the two pathways does occur [9-10]. Therefore, to some extent, the IPP synthesis of the two pathways has a compensatory function, which may also be one of the reasons why the MEP pathway in plants has not been discovered earlier. However, to date, there has been no research on the MEP pathway in ginseng. In addition, it remains to be studied whether both pathways or only one of them plays an important role in ginsenoside synthesis.

In ginseng, the biosynthetic pathwaysСтероиды и тритерпеноиды имеют Один и тот же прекурсор, 2,3- оксидосвален, и этапы циклизации до 2,3- оксидосвалена и разветвления одинаковы в обоих направлениях. В женьшене синтез фитостеролов и тритерпеноидов начинается с продукта 2,3- окислительной циклизации, катализируемой окислительной цикликой (окс). В женьшень, β-amyrin synthase (β-AS), dammarane synthase (DS) и cycloartanene synthase (CS) относятся к семейству оксидоскуленов cyclase (OSC) и расположены в точке разветвляемости биосинтеза тритерпеноидов и стеролов (рис. 1). Кас катализирует образование циклоартанола, может быть использована в качестве прекурсора для растений стеролов. DS и β- как прекурсоры женьшеня, с DS обеспечивая тетрациклический dammarane скелет для синтеза женьшеня типа dammarane и β- как обеспечивая тетрациклический скелет для синтеза женьшеня типа оланань. Полуфабрикаты dammarane и β-boswellic acid могут быть преобразованы в женьшень через серию гидроксилирующих и гликозилирующих реакций [11-13]. Цитохром P450, как полагают, участвуют в гидроксилировании женьшеня скелета [14], в то время как гликозилтрансферазы участвуют в гликозилации женьшеня скелета [14].

3 клонирование и исследования генов кодирования ферментов, участвующих в биосинтезе женьшенозида

Lee et al. [15] isolated the full-length cDNA clone of SS (PgSS1, accession number: AB115496) through EST 3. АнализЖеньшень (женьшень)leaf cDNA libraries. PgSS1 is considered to be a multi-copy gene or a gene with several introns. Overexpression of PgSS1 enhanced the activity of the PgSS1 enzyme, resulting in a significant increase in plant sterol and ginsenoside content. These results indicate that PgSS1 is not only a key regulatory enzyme in Фитостерол (фитостерин)biosynthesis, but also in ginsenoside biosynthesis. The same results were also found in the heterologous overexpression of Женьшень панаксPgSS1[16], в котором уровни фитостеролов (B-sitosterol, stigmasterol) и тритерпене сапонинов увеличились в 2-2,5 раза в трансгенном женьшене Panax. Кроме того, это говорит о Том, что в других растений гетерологический избыточный уплотнение генов, участвующих в биосинтезе женьшеня triterpene saponin, может использоваться для повышения уровня женьшеня и разъяснения механизма биосинтеза женьшеня.

Кусиро и др. [12] выделили два различных гомологических клона cDNA, кодирующих β-AS synthase (PNY1 и PNY2) от корень женьшеня. Эти два шага могут иметь общего предка, который развивался через несколько копий и мутаций во время эволюции. Определена ключевая внутренняя часть фермента, образующего β-asarone (PNY1). Кроме того, в ходе проведенного под руководством сайта исследования мутации PNY1 был выявлен единственный аминокислотный остаток Tyr261, который имеет решающее значение для конкретности продукта. У-амирин и его метаболиты часто зависят от тканей [17], что может быть причиной только Один тип олаанан-тип сапонин (Ro) был идентифицирован женьшень.

Dammarane synthase (DS) считается наиболее важным биосинтическим ферментом женьшеня. Под его каталитическим действием 2,3- окислитель-квален преобразуется в (20с)- даммаран, а не (20р)- даммаран. В последнее время исследователи используют технологию рт-ПЦР для клонирования синтазы dammarane-II [18]. Этот DS содержит 2310 бп ORF, кодирующий полипептид 770 аминокислот, и прогнозируемая молекулярная масса этого полипептида составляет 88,3 кда. Кроме того, вмешательство РНК DS в трансгенный женьшень может заставить замолчать выражение DS, что приведет к 84,5% сокращению производства сапонина у корней женьшеня [19]. Эти результаты показывают, что DS является ключевым ферментом, участвующим в биосинтезе женьшеня, и поэтому чрезмерная сжатие DS может значительно повысить биосинтез женьшеня.

So far, only SS, DS, β-AS and CS have been studied. In ginseng, a gene (accession number AB009031) encoding for the production of ginsenoside protopanaxatriol has been identified [20], suggesting a novel plant sterol synthesis pathway in ginseng. In addition, the results of expression 1. Последовательность действийtag (EST) analysis of cDNA libraries from different tissues of ginseng [5, 14, 21] showed that candidate genes related to ginsenoside 2. Биосинтезencode enzymes such as HMGR, FRS, geranylgeranyl diphosphate synthase, cytochrome P450, glycosyltransferase, β-glucosidase and lupeol synthase (LUS).

Перспективы на будущее

Among the various chemical components of Женьшень, женьшень are its main active ingredients. Currently, most studies have focused on the saponin components. Before the MEP pathway was discovered in bacteria and plants, the MVA pathway was considered the only synthetic route for the synthesis of triterpenoid saponins from IPP and DMAPP. The MEP pathway has now been shown to exist in a variety of plants; however, more research is needed on the MEP pathway in ginseng.

Молекулярная биология и методы энзимологии были эффективно использованы для выявления механизма биосинтеза женьшеня, и все больше и больше полных cDNA последовательности генов и потенциальных генов кодирования ферментов, связанных с биосинтезом женьшеня были получены. Кроме того, эбт широко используется для клонирования генов и выражения синтазы сквалена (HMGR, FPS, farnesyl diфосфат synthase, SE), необходимой для синтеза женьшеня и ферментов, требуемых на последующих этапах (цитохром P450, гликозилтрансферазы, b-глюкозидазы). Кроме того, открытие гена-кандидата для синтеза люпела и ланостерола в женьшене улучшило понимание метаболических путей в женьшене. Традиционно корни женьшеня считаются основной тканью для биосинтеза женьшеня. Однако DS, ответственные за большинство биосинтеза женьшеня, выражены на самом высоком уровне в цветочных почках женьшеня [19]. Это говорит о Том, что женьшень цветочные почки могут быть идеальным материалом для дальнейшего сечения биосинтеза женьшень путь.

До сих пор основными методами, используемыми для идентификации генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе женьшеня, были рт-ПЦР [12-13] и EST анализ [5, 14, 21]. Создана бактериальная искусственная хромосомная библиотека женьшеня, основанная на геномике женьшеня. Эти ресурсы могут использоваться не только для выявления генов, связанных с женьшенем, но и для разъяснения механизмов регулирования экспрессии генов. В последние годы RNAi стал очень эффективным техническим средством в метаболической инженерии растений. Он может эффективно препятствовать выражению конкретных генов и может использоваться в качестве инструмента для будущего обнаружения генов, участвующих в регулировании обмена женьшеня и функциональной проверки. Использование технологии RNAi позволяет анализировать гены, связанные с синтезом женьшеня, в больших масштабах и с высокой эффективностью, а также более эффективно и точно выявлять возможные метаболические регулятивные гены и проверять их функцию [22]. В настоящее время, несмотря на значительный прогресс в выявлении путей синтеза женьшеня, исследования каталитического уровня соответствующих ферментов еще не проводились. Кроме того, последующие шаги биосинтеза женьшеня все еще нуждаются в уточнении, и еще предстоит пройти долгий путь для анализа биосинтеза женьшеня.

Женьшень сапонин является важным компонентом вторичных метаболитов, и их содержание и состав определяются главным образом ключевыми ферментами в биосинтезе и уровнями их выражения в клетках. Метаболизм растительных стеролов и тритерпеноидов является весьма сложным и динамичным процессом, который регулируется многочисленными факторами. Есть еще много вопросов, на которые необходимо ответить, прежде чем метаболический путь женьшеня может быть полностью прояснен. Однако, учитывая экономическую и фармакологическую важность женьшеня, это все еще важная область, над которой стоит работать.

Ссылка:

[1]HONG S G,LEE K H,KWAK J, и др. разнообразие дрожжей, связанных с Panax женьшень [J]. Журнал микробиологии,2006,44: 674-679.

[2] У цон, чжоу юньцюнь, сунь чао и др. Биосинтез женьшенозида и технология вторичного метаболизма [J]. Китайский журнал биологической инженерии, 2009, 29(10): 102-108.

[3] лян и чжао с. Прогресс в понимании биосинтеза женьшеня [J]. Биология растений,2008,10:415-421.

[4]OKAZAKI H, taзои F,OKAZAKI S, и др. Журнал липидных исследований,2006,47: 1950-1958.

[5]KIM M K,LEE B S,IN J G,et al.Comparative analysis of Бывшая югославская республика македонияse- quence tags (эбт)  of  Женьшень лист [J]. На территории предприятия 1. Ячейка Республика,2006,25: 599 -606.

[6]HELMS S. Профилактика рака и лечение: Panax женьшень [J]. Alterna- tive Medicine Review,2004,9: 259-274.

[7] эйзенвайч W, менхард B,HYLANDST P J, и др. исследования по би-осинтезе таксола: таксановый углеродный скелет не имеет мевалоноидного происхождения [J]. Биохимия,1996,93: 6431 — 6436.

[8]SEEMANN M,TSE SUM BUI B,WOLFF M, и др. FEBS письма,2006,580: 1547 - 1552.

[9] хеммерлин а, хэффлер джей ф, мейер о и др. перекрестный разговор между ними Цитозолический мевалонат и плазтидиальные метилеритритолофосфатные пути В табаке ярко желтые 2 клетки [J]. Журнал биологической химии,2003,278: 26666-26676.

[10]ROHDICH F,ZEPECK F,ADAM P, и др. Труды ан США,2003,100: 1586-1591.

[11] кусиро т, оно и, шибуя м, и др. in vitro преобразование 2,3 - оксидоскалена в dammarenediol Panax женьшень микросомы [J]. Биологический и фармацевтический бюллетень,1997,20: 292-294.

[12] кусиро т, сибуя м, эбзука и. Бета-амирин синтаза: клонирование оксидоскаленовой циклозы, которая катализирует формирование наиболее популярного тритерпена среди высших растений [J]. Eur J Biochem,1998,256: 238-244.

[13] кусиро - ти, шибуя  - привет, эбизука - Y. 10. Молекулярная структура  1. Клонирование of  Окс-ido- сквален.cyclase cDNA от Panax женьшень: изоген, который кодирует - бетаамирин - синтакэйз. На пути к миру По окружающей среде В области медицины Объединенных наций в области 21 - е заседание Век [J]. Выдержка из "медика интернешнл" Конгресс организации объединенных наций Серия,1998,1157: 421-428.

[14]JUNG J D,HAHM Y,HUR C G, и др analysis  of ginseng  exp ressed  sequence  Теги [J]. Заводская клеточная Rep,2003,22: 224-230.

[15]LEE M H,JEONG J H,SEO J W,et al.Enhanced triterpene and phytos- terol biosynthesis  in  Panax ginseng   Чрезмерная нагрузка на персонал  squalene  Synthase джин [J]. Физиология растительных клеток,2004,45 (8) : : 976-984.

[16]SEO J W,JEONG J H,SHIN C G,et al.overpression squalene syn- thase in - элеутероккус «Сентикоз» (senticosus) Увеличение объема ресурсов phytosterol  and  Накопление тритерпенов [J]. Химия,2005,66: 869 — 877.

[17]PHILLIPS D R,RASBERY J M,BARTEL B,et al.Biosynthetic diversity При циклизации растений [J]. Современное мнение в области биологии растений,2006, 9: 305-314.

[18] пимпимон тансакул м с, тецуо кусиро, ютака эмидзука. Dammarenediol-II synthase, первый специализированный фермент для женьшень bi- osynthesis, в Panax женьшень [J]. FEBS письма,2006,580: 5143-5149.

[19]HAN J Y,KWON Y S,YANG D C,et al.Expression и RNA interfer- ence- индуцированное силой глушение of  the  Dammarenediol synthase ген в Panax женьшень [J]. Физиология растительных клеток,2006,47 (12) : 1653 — 1662.

[20]SUZUKI M,XIANG T,OHYAMA K,et al.Lanosterol synthase indicotyle- donous растения [J]. Физиология растений и клеток,2006,47: 565-571.

[21]CHOI D W,JUNG J,HA Y I,et al.Analysis of transin метилjas manat-обработанный женьшень волосатые корни для выявления генов, участвующих в био-синтезе женьшеноидов и других Вторичные метаболиты [J]. На территории предприятия 1. Ячейка Республика,2005,23: 557 — 566.

[22] Пан сичун, сан мин, чжан лей и др. RNA интерференция и ее применение в метаболической инженерии лекарственных растений [J]. Китайская травяная медицина, 2005, 36(9): 1281-1284.