Как производить порошок гиалуроновой кислоты методом ферментации?

Гиалуроновая кислота (га)Является макромолекулярным полисахаридом, который был впервые изолирован и очищен от животного юмора крупного рогатого скота мейером и другими в 1934 году, следовательно, его другое название, гиалуронан [1]. Гиалуроновая кислота представляет собой однородно повторяющийся линейный полисахарид глюкозамина, состоящий из 2 000-25 000 дисаксаридов глюкозаминовой кислоты и n-ацетилглюкозамина, попеременно связанных грав1,3 гликозидическими связями и грав1,4 гликозидическими связями [2].

Гиалуроновая кислота является важным компонентом внеклеточной матрицы (экм) [1]. Недавние исследования показали, что гиалуроновая кислота не только широко присутствует во внеклеточной матрице между клетками, но и существует внутри клетки, в основном концентрируется в цитоплазме и ядре новорожденных клеток [2]. Помимо нахождения в стекловидном теле, гиалуроновая кислота также обилия в синовиальной жидкости суставов и в пространстве между эпидермальными клетками. С точки зрения количества, более 50% гиалуроновой кислоты находится в дерме и эпидермисе кожи, и около 35% находится в мышцах и костях. В настоящее время считается, чтоГиалуроновая кислотаВ основном находится в инертном пространственном наполнителе мягкой соединительной ткани, играет важную роль в формировании протеоглыканских комплексов [2].

1 свойства гиалуроновой кислоты

Под электронным микроскопом,Молекулы гиалуроновой кислотыНаблюдается линейная одноцепная структура, которая в водном растворе превращается в случайную структуру катушки диаметром около 500 нм. Каждая дисаксаридная единица в молекуле гиалуроновой кислоты содержит карбоксиловую группу, которая в физиологических условиях может распадаться на анион. Взаимное отталкивание анионов на равных пространственных расстояниях приводит к тому, что молекула находится в свободном расширенном состоянии в водном растворе, занимая большое пространство, поэтому она может связывать более чем в 1000 раз больше собственного веса в воде [3].

В зависимости от источника иМетод экстракции гиалуроновой кислоты, его относительная молекулярная масса (Mr) 8-5-106[4]. Структура и биологическая активность гиалуроновой кислоты зависят от ее относительной молекулярной массы. Гиалуроновая кислота с низким молекулярным весом образует раздробленную сеть при низких концентрациях, в то время как гиалуроновая кислота с высоким молекулярным весом образует полную сеть [3].

Из-за водородных связей внутри молекулы,Молекулы гиалуроновой кислотыПринять односпиральную структуру в водном растворе [5]. Когда концентрация гиалуроновой кислоты в растворе достигает определенного уровня, молекулы гиалуроновой кислоты взаимодействуют друг с другом, образуя двухспиральную структуру, а сетевая структура формируется при более высоких концентрациях [3]. В настоящее время общепринятой теорией гиалуроновой кислоты является теория третичной структуры, которая гласит, что каждая трисакхаридная единица в молекуле гиалуроновой кислоты имеет гидрофобную область. При высокой концентрации раствора гидрофобные области молекул гиалуроновой кислоты взаимодействуют, образуя двухспиральную структуру, которая является основой для агрегирования молекул гиалуроновой кислоты [6].

Гиалуроновая кислотаХарактеризуется очень высокой вязкостью [2]. При низких концентрациях или низких относительных молекулярных массах вязкость раствора мало меняется с увеличением концентрации или г-н, когда вязкость достигает 10 мпа · с после увеличения г-н и концентрации, начинают переплёскиваться молекулы гиалуроновой кислоты, в то время как вязкость быстро увеличивается с увеличением г-н и концентрации [3].

2 технология производства гиалуроновой кислоты порошка

Имеются три метода производства гиалуроновой кислоты, а именно экстракция, микробная ферментация и синтез [1].

Метод извлечения включает в себяЭкстракция гиалуроновой кислотыИз тканей человека или животного [1]. Метод экстракции был первым методом, использованным для получения гиалуроновой кислоты. В настоящее время основным сырьем, используемым в производстве, являются куриные комбы, пуповинные шнуры и глаза животных. Основные этапы процесса включают извлечение, удаление примесей, энзиматический гидролиз, осадки и отделение. Процессы экстракции и очистки гиалуроновой кислоты из различных тканей в некоторой степени различаются [3]. Однако, из-за ограниченного источника сырья для данного метода добычи, уровень добычи продукции крайне низок (всего около 1%), а процесс сложный, поэтому трудно сократить производственные затраты. Кроме того, поскольку гиалуроновая кислота сочетается с другими высокомолекулярными веществами в тканях животных, ее труднее отделить и очистить, а продукты гиалуроновой кислоты, извлекаемые из тканей животных, могут вызывать инфекцию. Эти факторы ограничивают широкое применение метода экстракции в таких отраслях, как медицина и косметика [2, 3].

Синтетический метод предполагает сначала синтез a"Производная оксиридина гиалуроновой кислоты"Используя биологическую макромолекулу, затем добавляя воду и гиалуронидазу из яичников овец или крупного рогатого скота для подготовки комплекса производных и фермента, и, наконец, удаляя ферменты для очистки гиалуроновой кислоты [1]. Синтетический метод все еще находится на стадии лабораторных исследований и пока не применяется в промышленном производстве [1].

Метод микробной ферментации относится к использованию отфильтрованных бактерий для проведения ферментации и культуры, а продукт гиалуроновой кислоты получается путем его изоляции и очистки от брота ферментации [1]. Из-за вышеупомянутых недостатков метода экстракции и того факта, что синтетический метод еще не созрел, метод микробной ферментации стал самым важным методом дляПроизводство гиалуроновой кислоты- да. Ниже приводится более систематический обзор метода микробной ферментации для производства гиалуроновой кислоты.

2.1 размножение бактерий, производящих гиалуроническую кислоту

Самые ранние обнаруженные микроорганизмыПроизводить гиалуроновую кислотуБыл стрептококковый пёген, который был открыт в 1937 году для производства гиалуроновой кислоты [7]. Впоследствии, в 1939 году, было обнаружено, что Streptococcus equisimilis и S. zooepidemicus также способны производить гиалуроновую кислоту [7]. Поскольку дикие стрептококки могут производить гиалуроновую кислоту,  Установлено также, что сегнодимус (S. zooepidemicus) и стрептококк способны производить гиалуроновую кислоту [7].

Так как дикий тип стрептококка имеет недостатки, такие как способность производить гиалуронидазу, выражать другие внеклеточные белки, иНизкая гиалуроновая кислотаПроизводство [2] штаммы дикого типа должны быть изменены различными способами в фактическом производстве для удовлетворения потребностей промышленного производства.

2.1.1 разведение мутагенеза

Мутагены в основном включают физические мутагены, химические мутагены и биологические мутагены. В настоящее время мутагены используются в размноженииШтаммы, вызывающие гиалуроническую кислотуВ основном включают ультрафиолетовое излучение, 60Co γ rays и нитрогуанидин (NTG) [7]. Многие исследования показали, что при лечении некоторых оригинальных штаммов, которые могут производить гиалуроновую кислоту, таких как стрептококковая зоэпидемика и стрептококковая экви, с различными мутагенными методами лечения могут быть получены отличные штаммы с высокой гиалуроновой кислотой или относительно высокой молекулярной массой гиалуроновой кислоты, или негативные реакции после предварительной обработки гиалуронидазой, или негемолизом, или сочетанием вышеуказанных характеристик [7].

2.1.2 культура протопласта

Поскольку протопласты не имеют клеточных стен, они более чувствительны к изменениям окружающей среды, чем обычные клетки, и более решительно реагируют на мутагенные методы лечения [7]. Были проведены успешные эксперименты с использованием химических мутагенов, таких как NTG или физических мутагенов, таких как лазеры, для обработки протопластов первоначальных штаммов с целью получения высокоурожайных штаммов [7].

2.1.3 генная инженерия

Ген, кодирующий фермент, участвующий вСинтез гиалуроновой кислотыПуть в стрептококке расположен на одной обратной транскриптазе и называется оперон. В Streptococcus pyogenes операн состоит из трех генов: hasA (1248 б.п.), кодирующая гиалуроновую кислоту synthase (42,0 у.п.), hasB (1204 б.п.), кодирующая udp-глюкозу дегидрогеназу (47,0 б.п.) и hasC (915 б.п.), кодирующая udp-глюкозу пирофосфорилазу (33,7 б.п.) [2]. Хотя еще не ясно, как цепи гиалуроновой кислоты переносятся через клеточную мембрану, выражения гиалуроновой кислоты синтазы и удп-глюкозы гидрогеназы в энтерококковых факалиях, эшерихии коли и Bacillus subtilis достаточно для направления производства и транспортировки гиалуроновой кислоты [2]. Поэтому гиалуроновая кислота может быть получена просто путем переноса генов hasA и hasB в клетку хоста и их выражения в клетку хоста [7].

Ген HA синтеза мукоидного газа S43/192/4 Streptococcus agalactiae group A был впервые клонирован и построен в пласмиде Escherichia coli в 1993 году и успешно выраженный в E. coli для синтеза HA [8]. Впоследствии ген HA синтеза Streptococcus agalactiae group C был клонирован и выражен в E. coli в 1997 году [8].

Линг мин и др. [9] усилили ген sqhas из общей ДНК Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus, создал выражение plasmid и превратил его в E. coli DH5α, успешно выразил sqHAS белка, и синтезировал га в присутствии субстрата. Чжан цзиню и др. [10] клонировали ген hasB Streptococcus zooepidemicus и выразили его в E. coli, чтобы получить соответствующий белок.

Исследовательская группа Chien в китайской провинции Тайвань внедрила гены hasA и hasB Streptococcus zooepidemicus в Lactococcus lactis через систему NICE inducible expression, и успешно получила инженерный штамм, которыйПроизводит гиалуроновую кислоту[11].

Шэн юй [12] ввел ген синтазы zooepidemicus hyaluronan Streptococcus в Lactococcus lactis через систему индуцируемого выражения NICE (контролируемую низином) и успешно выразил его для синтеза HA.

2.2 оптимизация условий ферментации

Стрептококчи бактерии с высокими требованиями к питанию, которые должны расти на богатых питательными веществами средств массовой информации. Стрептококчи обычно растут на сложных средах, содержащих смесь дрожжей или экстрактов животных, пептона и сыворотки. Состав этих сред всегда включает глюкозу (10-60 г/л), аминокислоты, нуклеотиды, большое количество соли, микроминералов и витаминов [2].

PH и температура очень важны для роста Streptococcus zooepidemicus иПроизводство гиалуроновой кислоты- да. Некоторые исследования показали, что условия pH 6.7 ± 0.2 и температуры 37 °C наиболее подходят для роста Streptococcus zooepidemicus и производства гиалуроновой кислоты [13]. Скорость возмущения также влияет на производство гиалуроновой кислоты. Исследования показали, что в условиях низких темпов агитации производство молочной кислоты является высоким, а производство гиалуроновой кислоты-низким [13]. Высокоскоростное возбуждение может уменьшить эффект синтеза молочной кислоты и увеличить производство гиалуроновой кислоты, но может также уничтожить полимеры гиалуроновой кислоты и уменьшить их относительную молекулярную массу [13]. Начальная концентрация глюкозы оказывает значительное влияние на относительную молекулярную массу гиалуроновой кислоты. Исследования показывают, что при увеличении первоначальной концентрации глюкозы с 20 г/л до 40 г/л относительная молекулярная масса гиалуроновой кислоты также увеличивается с (2.1±0.1)×106 до (3.1±0.1)×106 [13].

Liu et al. [14] сообщили, что в процессе пакетной ферментации Streptococcus zooepidemicus пероксид водорода (1,0 ммоль/г га) и аскорбиновая кислота (0,5 ммоль/г га) добавлялись при 8 и 12 ч, соответственно, что вызывало редоксДеполимеризация гиалуроновой кислоты, что привело к снижению относительной молекулярной массы и повышению урожайности с 5,0 г/л до 6,5 г/л.

3 применения гиалуроновой кислоты

Из-за большого количестваСвойства гиалуроновой кислотыКак упоминалось выше, он широко используется во многих областях. Ниже в основном резюмируется применение гиалуроновой кислоты в косметике, медицинских продуктах и медицинской и фармацевтической областях.

3.1 применение гиалуроновой кислоты в косметике

Гиалуроновая кислотаВ основном встречается во внеклеточной матрице между клетками, где она имеет функцию поддержания внеклеточного пространства клеток ткани, ускорения потока питательных веществ, и поддержания ткани. Во-первых, по сравнению с традиционными увлажняющими средствами, гиалуроновая кислота оказывает более сильное увлажняющее воздействие и имеет преимущества нежирной и не засоряющейся поры. Во-вторых, водный раствор гиалуроновой кислоты имеет высокую вязкость и смазку, что помогает сформировать воздухопроницаемую увлажняющую пленку на поверхности кожи, чтобы сохранить кожу увлажненной. В-третьих, небольшие молекулы гиалуроновой кислоты могут проникать в дермы, способствовать микроциркуляции крови и помогать коже поглощать питательные вещества, которые могут оказывать косметическое и оздоровительное воздействие. Наконец, гиалуроновая кислота может удалять свободные от активного кислорода радикалы в коже, вызванные ультрафиолетовым излучением, обеспечивая защиту от солнца и ремонт [15].

Из-за большого количестваПреимущества гиалуроновой кислоты, широко используется в косметике в качестве идеального естественного увлажняющего фактора для увлажнения, эмолиента, против морщин и солнцезащитного крема. Обычная сумма добавления составляет 0,05% до 0,50% [15].

3.2 применение гиалуроновой кислоты в медицинских препаратах

С тех порГиалуроновая кислота имеет различные свойстваТакие как удержание воды, смазка, содействие заживлению ран и защитные клетки, уменьшение гиалуроновой кислоты в организме может привести к многим проблемам, таким как артрит, старение кожи, и увеличение морщин. Поэтому оральная добавка гиалуроновой кислоты в дополнение к эндогенной гиалуроновой кислоте в настоящее время считается одним из эффективных способов сохранения красоты и здоровья и продления жизни [16].

Теоретические основы дляПероральная гиалуроновая кислотаЯвляется то, что после перорального пищеварения, гиалуроновая кислота может увеличить прекурсоры для синтеза гиалуроновой кислоты в организме, тем самым увеличивая количество гиалуроновой кислоты синтезируется в организме и нацеливается на ткани, такие как кожа, чтобы оказать свое воздействие. В настоящее время запущены различные продукты пероральной гиалуроновой кислоты, такие как таблетки, капсулы и пероральные жидкости [16].

3.3 применение гиалуроновой кислоты при лечении

Широко используется гиалуроновая кислотаВ офтальмологии, ортопедии и многих других медицинских областях благодаря своей уникальной вязкости, биосовместимости и неиммуногенности [17].

При глазных болезнях предпочтительным направлением лечения является актуальное офтальмологическое администрирование. Что касается офтальмологических препаратов, то биодоступность препарата положительно коррелируется с вязкостью жидкости в определенном диапазоне. Повышение вязкости может продлить срок пребывания препарата в глазу и, таким образом, повысить эффективность. Однако некоторые усилители вязкости могут вызывать побочные эффекты, такие как дискомфорт глаз. Гиалуроновая кислота преодолевает этот недостаток из-за своих не ньютоновских свойств жидкости и хорошей биосовместимости. Поэтому это хороший офтальмологический препарат вязкости, который стоит разрабатывать и применять [18]. В дополнение к применению в глазных капель, гиалуроновая кислота также может быть использована для лечения сухих симптомов глаза. В настоящее время гиалуроновая кислота используется вместе с другими высокомолекулярными полимерами для улучшения симптомов сухих глаз [19].

Гиалуроновая кислота является основным компонентом суставного хряща и синовиальной жидкости. При развитии остеоартрита, ревматоидного артрита и других заболеваний суставов образование и метаболизм гиалуроновой кислоты в суставах является аномальным, а концентрация и относительный молекулярный вес гиалуроновой кислоты в синовиальной жидкости значительно снижаются, что нарушает процесс деградации хрящей. Это привело к развитию вискоэластической дополнительной терапии, которая лечит заболевания суставовДополнение экзогенной гиалуроновой кислоты- да. Эта терапия становится все более популярной как у врачей, так и у пациентов из-за ее долгосрочной эффективности и нескольких побочных эффектов [20].

Кроме того, гиалуроновая кислота также широко используется в системах доставки лекарственных средств в качестве различных носителей (таких как лекарственные средства, предназначенные для борьбы с опухолями, невирусные векторы генной терапии и носители для- пептид.И протеиновые препараты, как имплантирующие материалы в хирургии и при лечении повторяющихся язв ротовой полости [17].

Перспективы на будущее

Гиалуроновая кислота постепенно применяется в различных областях, метод микробной ферментации для производстваПорошок гиалуроновой кислотыПостепенно заменит метод экстракции и станет основным методом промышленного производства гиалуроновой кислоты. Начало производства гиалуроновой кислоты на иностранном предприятии свидетельствует о Том, что производство гиалуроновой кислоты вступило в стадию применения современной биотехнологии. В будущем будут выбраны штаммы, которые могут производить гиалуроновую кислоту с различными относительными молекулярными массой, и за счет постоянной оптимизации условий ферментации будут обеспечены продукты гиалуроновой кислоты, которые могут использоваться в различных областях. Гиалуроновая кислота также будет использоваться все более широко во многих областях.

Справочные материалы:

[1] линг пейкшу. Исследования и применение гиалуроновой кислоты [м]. Пекин: люди и общество#39; изд-во мединститута, 2010. 1- 6.

[2] CHONG B F, BLANK L M, MCLAUGHLIN R, et al. Производство микробной гиалуроновой кислоты [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(4): 341-351.

[3] лю лонг. Управление процессами и оптимизация производства гиалуроновой кислоты методом ферментации зоэпидемиков стрептококка [D]. Вуси цзянсу: университет цзяньнань, 2009.

[4] цзян цюянь, лин пейшу, лин хонг и др. Исследование термической деградации гиалуроновой кислоты [J]. China Pharmaceutical Industry Journal, 2006, 37(1): 15-16.

[5] STERN R, ASARI A A, SUGAHARA K N. Hyaluronan fragments: A information rich system [J]. Eur J Cell Biol, 2006, 85(8): 699-715.

[6] BARBUCCI R, LAMPONI S, BORZACCHIELLO A, et al. Гиалуроновая кислота гидрогель в лечении остеоартрита. Биоматериалы, 2002, 23(23): 4503-4513.

[7] ши янли, го сюэпин, луан йихон. Обзор размножения бактерий, производящих гиалуроническую кислоту [J]. Продукты питания и лекарственные средства, 2006, 8(10): 22-24.

[8] чжэн сюэлинг, ван фэньшань, линг пейшу. Исследование синтазы гиалуроновой кислоты [J]. Фармацевтическая биотехнология, 2004, 11(6): 413 — 416.

[9] линг мин, хуан рибо, хуан кун и др. Молекулярное клонирование и выражение гена синтазы гиалуроновой кислоты Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus [J]. Промышленная микробиология, 2003, 33(2): 4-8.

[10] чжан цзиньюй, у сяомин, хао нин и др. Клонирование и определение характеристик генного хасса, связанного с синтезом гиалуроновой кислоты, стрептококкового зоэпидемика [J]. Китайский журнал биотехнологии, 2005, 25(7): 86-91.

[11] CHIEN L J, LEE C K. Hyaluronic acid production by recombinant Lactococcus lactis [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 77(2): 339-346.

[12] шэнг й. установление пути синтеза гиалуроновой кислоты в лактококковых лактококках и предварительное исследование механизма регулирования относительной молекулярной массы микробной синтезированной гиалуроновой кислоты [D]. Цзинань: шаньдунский университет, 2009.

[13] ши л, ван ф с, го х п и др. Исследование производства гиалуронанов путем ферментации [J]. Материалы китайской ассоциации науки и техники, 2006 год, 2(4): 268-271.

[14] LIU L, DU G C, CHEN J, et al. Микробное производство гиалуроновой кислоты с низким молекулярным весом путем добавления пероксида водорода и аскорбата в культуру партии Streptococcus zooepi- demicus [J]. Биоресурсная технология, 2009, 100(1): 362 — 367.

[15] го фэнгсян, линг пейшу, го сюэпин и др. Физиологические функции гиалуроновой кислоты и ее применение в косметике и косметических и оздоровительных продуктах [J]. Бизнес-индустрия китая, 2002 год (9): 45-46.

[16] сон юнмин, го сюэпин, луан ихон и др. Новая ресурсная пища — гиалуроновая кислота [J]. Продукты питания и лекарственные средства, 2009, 11(5): 56-59.

[17] ван сюю, лин пейшу, чжан тяньминь. Новые разработки в области исследований и применения гиалуроновой кислоты [J]. Продукты питания и лекарственные средства, 2006, 8(12): 1-3.

[18] лин пейшу, гуань хуаши, ронг сяохуа и др. Прогресс в исследованиях офтальмологических систем доставки лекарственных средств [J]. Китайский фармацевтический журнал, 2006, 41(1): 7-9.

[19] линг пейшу, чжан тяньаньминь, ли ци и др. Применение и исследование гиалуроновой кислоты в офтальмологических препаратах [J]. Китайская медицина и клиническая практика, 2004, 4(9): 697-699.

[20] линг пейшу, хэ янли, чжан цин. Лечебное действие гиалуроновой кислоты на остеоартрит [J]. Продукты питания и медикаменты, 2005, 7(1): 1-3.