4 методы испытания Haematococcus Pluvialis Astaxanthin

Астаксантин, химически назван 3,3 и#39;- дигидрокси-бета, бета'- каротин -4,4' дион принадлежит каротеноидам кето. Исследования показали, что астаксантин является сильнейшим природным антиоксидантом [1-2]. Астаксантин обладает антиоксидантными, антирадиационными, антистареющими, противоопухолевыми и сердечно-сосудистыми заболеваниями функциями профилактики и лечения [2-3] и поэтому имеет чрезвычайно высокую экономическую ценность. Используется в медицинских продуктах, лекарствах, кормовых добавках, косметике, функциональных продуктах питания, пищевых добавках и других областях [4].

Основным сырьем для производства астакзантина являются креветки и ракушки крабов [3, 5], гематококковая плувиалиса [4] и родоторула глутини [6]. В их числе - гематококкpluvialis может аккумулировать астаксантин до 5% сухого веса в стрессовых условиях. Так как структура астаксантина содержит два атома chiral C, структура в - гематококкpluvialis составляет 3S, 3S' синтетическая форма представляет собой смесь киралов, в основном 3R, 3R'. Haematococcus pluvialis считается лучшим источником естественного астаксантина производства.

Haematococcus pluvialis образует гематококковую оболочку, похожую на гематологическую оболочку, наружную стену после стресса. Когда пигмент в клетках извлекается, традиционным растворителям трудно проникнуть внутрь клеток для извлечения пигмента. Как правило, необходимо комбинировать метод разрушения клеточных стен. Во-вторых, астаксантин в клетках Haematococcus pluvialis в основном существует в виде астаксантин эфиров, то есть астаксантин молекул моноэфира и астаксантин дистер молекул с различными цепочек acyl. Анализ HPLC трудно обеспечить базовое разделение всех молекул, и молекулярный вес отличается при расчете содержания.

Кроме того, астаксантин нестабилен и подвержен деградации в таких условиях, как свет и тепло, поэтому существуют определенные проблемы с точным определением астаксантина. В настоящем документе рассматривается нынешнее состояние исследований с точки зрения извлечения, гидролиза и обнаруженияAstaxanthВ случае необходимостиот Haematococcus pluvialis, с целью обеспечения руководства по выбору соответствующих методов для быстрого определения содержания астакзантина в гематококковой плювиалисе для различных целей.

1 извлечение астаксантина из гематококковой плавиалисы

Извлечение астаксантина является основой для точного определения его содержания, а также одним из неясных аспектов измерения астаксантина. В стрессовых условиях клетки гематококка плювиалиса аккумулируют астаксантин, но рост и разделение клеток останавливаются, образуя немобильные споры, т.е. гематозные клетки. Зрелые гелатинные клетки имеют трехслойную толстую стенку из жестких клеток, наиболее удаленным слоем является водорослей, материал, который очень устойчив к гидролизу уксусной кислоты. Второй и третий слои состоят из равномерно и неравномерно распределенных манносовой и целлюлозы, соответственно [7].

Для гематококкового плувиалиса с гематоклеточной стенкой традиционные методы растворения и экстракции не могут войти внутрь клетки для извлечения пигмента.

В настоящее время в промышленности сверхкритическая технология извлечения CO2 [7], технология извлечения при высоком давлении/сверхвысоком давлении гомогенизация [8] и метод кавитации отрицательного давления [9] используются для извлечения астаксинтина из плавиалиса гематококка. Вышеуказанные методы могут эффективно извлекать астаксантин, но они требуют большого количества порошка водорослей и сложны в эксплуатации, поэтому они подходят для крупномасштабного промышленного производства. Методы экстракции, используемые для обнаружения астакзантина в плавиалисе гематококка, включают экстракцию растворителей, механическое шлифование + экстракцию растворителей, экстракцию диметилсульфоксида (дмсо) и разрыв стенок целлюлазы + экстракцию растворителей.

1.1 метод экстракции растворителей

Метод экстракции растворителей прост в эксплуатации, недорогостоящий и имеет низкие требования к оборудованию. Необходимо только оптимизировать экстракционный растворитель, соотношение жидкости к растворителю, температуру экстракции и время экстракции. Широко используемые растворители включают ацетон [10], этилацетат, дихлорметан, этанол и т.д. Однако из-за наружной стенки гематококковой оболочки свеклы обычные растворители не могут проникать в клетки, а скорость экстракции астакзантина является низкой. Мендеш-пито и др. сообщили, что ацетон используется в качестве экстракционного растворителя для астаксантина из плавиалиса гематококка и что коэффициент экстракции составляет лишь 4 мг · г -1 (извлечение астаксантина по массе на грамм порошка водорослей), в то время как механическое дробление + экстракция ацетона составляет 19 мг · г -1, что указывает на то, что растворитель не может войти в клетки для экстракции астаксантина [10].

Ruen-ngam сравнила методы экстракции растворителей с помощью ультразвука (экстракция с помощью ультразвука), микроволновой (экстракция с помощью микроволновой технологии) и сокшлета (экстракция с помощью сокшлета). Скорость экстракции астаксантина достигла 74% при помощи микроволновой помощи экстракции при 75 градус в течение 5 мин [11]. Кроме того, для повышения эффективности экстракции растворителя разрушение стенок химических элементов связано с обработкой клеток гематококковой плавиалии кислотами или щелочными веществами. Sarada et al. сообщили, что обработка клеток раствором гидрохлорной кислоты 2 моль · л -1 при температуре 70 °C в течение 2 мин с последующей экстракцией растворителем может обеспечить уровень экстракции астаксантина 86-94% [12]. Однако стоит отметить, что размещение астаксантина в высокой концентрации кислоты или щелочного раствора может легко привести к деградации астаксантина. Приведенные выше результаты свидетельствуют о Том, что из-за особого состава стенок гематококкового плувиалиса прямой экстракции растворителей в клетки войти не может, в то время как вспомогательные ультразвуковые, микроволновые и кислотные методы лечения подвержены деградации астаксантина и не подходят для его экстракции.

1.2 механическое разрушение стенок элементов + экстракция растворителей

Механические нарушения клеточных стенок является наиболее часто используемым методом в лаборатории, которая использует внешние силы, чтобы сломать клеточные стенки Haematococcus pluvialis. В национальном стандарте обнаруженияAstaxanthВ случае необходимостив Haematococcus pluvialisГб/т 31520-2015 [13], гематококковый плувиалис тщательно грунтовый с использованием стеклогомогензера, а его пигменты извлекаются с использованием дихлорметана-метанола в качестве растворителя. Метод механического дробления + экстракции растворителя чаще используется при обнаружении астаксантина [10, 14-16]. Механическое дробление может повредить клеточные стенки, а пигмент может быть полностью извлечен. Этот метод прост в использовании, но он требует, чтобы каждый образец был заземлен с помощью однородника клеток, что требует много времени и труда.

1.3 разрушение стенок целлюлазы + экстракция растворителей

Поскольку клеточная стенка Haematococcus pluvialis состоит главным образом из таких веществ, как целлюлоза, пектин и липополисахаридазы, целлюлаза, пектиназа и полисахаридаза используются для разрушения клеточной стенки Haematococcus pluvialis [8]. Чжоу цзиньке и др. исследовали новый ферзиматический метод извлечения астаксантина из Haematococcus pluvialis [17]. Целлюлаза: энзиматический гидролиз порошка водорослей, экстракция этанола. Оптимальными условиями процесса для ферзиматической экстракции являются: начальный pH ферзиматического раствора 4.5, температура ферзиматического гидролиза 45 градусов, дозировка фермента 1,5% и время ферзиматического гидролиза 15 часов. В этих условиях скорость экстракции астаксантина составила 94,6%, что на 61,5% выше, чем традиционный метод прямой экстракции этанола. Она имеет преимущества низкой рабочей температуры, меньшего загрязнения, низкой стоимости и высокой степени извлечения. Добиться экологически чистого промышленного производства легко, но этот метод требует много времени, и высокие температуры могут также привести к деградации астаксантина.

1.4 метод извлечения дмсо

Дмсо обладает хорошей растворителями и хорошей проницаемостью к клеткам. Часто используется в качестве усилителя просачивания для лекарств или пестицидов, а также в качестве защитного средства при криоконсервации клеток. Seely впервые сообщила, что DMSO может использоваться для извлечения микроводорослей хлорофилла и каротеноидов [18]. Буссиба и др. использовали DMSO для извлечения пигментов из Haematococcus pluvialis. Экстракция была проведена в 70 - грационной водяной ванне в течение 10 мин, а остатки водорослей можно сделать бесцветными, повторив экстракцию 2-3 раза в 70 - грационной водяной ванне [19], что показывает, что DMSO имеет хорошая проницаемость и может проникать в клетки Haematococcus pluvialis, чтобы полностью извлечь астаксантин. DMSO экстракция не требует обработки клеточных стенок свеклы гематококка, значительно упрощая процесс экстракции астаксантина, и была использована при - астаксантинdetect13. Ион[20-21]. Кроме того, мир 's ведущие компании по производству микроводорослей, такие как Cyanotech, Fuji в японии и China's Green A Bioengineering Company [8], все применили метод DMSO для извлечения астаксантина от Haematococcus pluvialis до - астаксантинобнаружения.

Использование DMSO в качестве опухающего агента может повысить проницаемость клеточной стенки, и может использоваться в качестве экстрагента для астаксинтина от Haematococcus pluvialis, упрощая процесс разрушения клеточной стенки, необходимой для обнаружения Haematococcus pluvialis.

2 гидролиза астаксантинских эфиров

Astaxanthin накопленный в Haematococcus pluvialis является все -trans 3S, 3S ' конфигурация с одной гидроксиловой группой в каждой эндокциклической структуре. Как правило, эстерифицируется жирными кислотами C16, C18 или C20, образуя астаксантинские эфиры для стабилизации своей структуры [22]. Большинство из них — астаксантинские моноэфиры, на долю которых приходится около 75%, астаксантинские диестеры, на долю которых приходится около 20%, и свободные астаксантинские — только 5% [12,23]. В Haematococcus pluvialis содержится до 30 различных типов астакзантиновых моноэфиров и диетологов [24]. Сложность - астаксантинВ европе и европеделает очистку и прямую и точную количественную оценку проблематичным. Поэтому извлекаемые астаксантинские эфиры должны быть гидролизированы в свободный астаксантин для обеспечения очистки одного вещества и точной количественной оценки с помощью ГПЛК. Как правило, существуют два метода гидролиза астаксантинских эфиров: сапонификация и энзиматический гидролиз.

2.1 сапонификация

Сапонификация, как правило, осуществляется в метаноловом растворе NaOH или KOH для гидролиза астаксантиновых эфиров в свободный астаксантин. Юань и др. показали, что высокая концентрация щелочи или температура реакции во время сапонификации способствует гидролизу астаксантиновых эфиров, но также ускоряет деградацию астаксантина [14]. Чэнь синцай и др. также показали, что концентрация свободного астаксантина снижается линейно с увеличением концентрации щелочи [25]. Юань и др. изучали кинетику гидролиза астаксантина при эстерсапонификации и деградации астаксантина при различных концентрациях щелочи. Результаты показали, что в 22 - грационной реакционной системе с концентрацией NaOH 0,0175 ~ 0,020 моль · л -1 астаксантонный эфир был полностью гидролизирован и не произошло деградации астаксантина. Однако более высокая концентрация ноо-метанола или более высокая температура реакции вызвали значительное разложение астаксантина [26]. Условия применения метода сапонификации астаксантинских эфиров суровы. Концентрация щелочного раствора, температура и время сапонификации в процессе сапонификации влияют на эффективность сапонификации и стабильность астаксантина, что является еще одним аспектом, влияющим на точное определение астаксантина.

2.2 метод гидролиза фермента

Чжао сообщил, что растворимый в воде щелочный эстеразы из циклоопиума пеницилия может преобразовать астаксантин эфиры в астаксантин. Условия реакции были инкубированы при 28 - гравном колебании в течение 7 часов, а восстановление астаксантина достигло 63,2% [27]. Однако этот фермент имеет низкую эффективность гидролиза и не широко используется при определении содержания астаксантина. Джейкобс впервые сообщил, что липидно-растворимый холестерин эстеразы может быстро гидролизировать каротеноидные эфиры [28]. Хотя в настоящее время в литературе мало докладов об этом ферзиматическом методе, он используется отечественными и зарубежными компаниями, производящими астаксантин, в качестве мягкого метода гидролиза. Используемый холестерин эстеразы не только полностью гидролизирует астаксантонный эфир, но и не легко вызывает окисление астаксантина, что позволяет точнее определить содержание астаксантина.

Применение холестерина эстеразы на экстракте Haematococcus pluvialis, содержащий астакзантин в течение короткого периода времени значительно повышает эффективность обнаружения астакзантина в Haematococcus pluvialis.

3 количественное обнаружение астаксантина в гематококковой плювиалисе

Основными методами обнаружения астаксантина являются спектрофотометрия, гидролиз-ГПЛК и ГПЛК-мс.

3.1 спектрофотометрия

Буссиба сообщил, что хлорофилл в гематококковой плувиалисе был уничтожен путем нагрева с 5% ко -30% метанола раствором в течение примерно 10 минут, а затем астаксантин был извлечен из дмсо. Поглощение измерялось на длине волны 475 нм для расчета концентрации астаксантина. Этот метод позволяет быстро оценить содержание астаксантина и широко используется в выращивании и производстве [12, 29]. Однако, согласно некоторым отчетам, обработка щелочного раствора для уничтожения хлорофилла этим методом приводит к 25-40% деградации астаксантина [16].

Поэтому ли и др#39 метод s путем непосредственного извлечения из дмсо без щелочной обработки и обнаружения на видимой длине волны 530 нм во избежание воздействия других каротеноидов и хлорофилла. Этот метод был использован для быстрого обнаружения астакзантина в гематококковой плювиалисе [16]. Geng Jinfeng' исследования s показывают, что содержание каротеноидов и astaxanthin в Haematococcus pluvialis в процессе выращивания находится в стабильном линейном соотношении. С помощью метода, который непосредственно и легко измеряет каротеноиды и косвенно получает astaxanthin содержание, каротеноидов можно быстро определить, а затем на основе соотношения полученных каротеноидов и astaxanthin, astaxanthin содержание в Haematococcus pluvialis можно быстро рассчитать. Данные из этой лаборатории также показывают, что существует хорошая линейная зависимость между содержанием каротеноидов, измеренным с помощью спектрофотометрии, и содержанием астаксантина, измеренным с помощью ферзиматических гидролиза-ГПЛК (рис. 1). Поэтому метод экстракции дмсо может непосредственно использоваться для определения содержания астаксантина с помощью спектрофотометрического метода при 475 нм, и отношением, показанным на рис. 1.

3.2 метод гидролиза-ГПЛК

После предварительной обработки пигмента плавиалиса гематококка путем сапонификации или ферзиматического гидролиза, HPLC может быть использован для точного определения свободного астаксантина. В настоящее время в национальном стандарте определения astaxanthin GB/T 31520-2015 используется метод ПЖК после сапонификации для определения [13]. Разделительная колонка представляет собой обратную фазу C30 колонки, а обнаружение всех транс-свободных astaxanthin, 9-cis- astaxanthin, и 13-cis-astaxanthin может быть обнаружено в 20 мин. Юань использовал C18 колонку для анализа astaxanthin esterс сапонином. Метанол/дихлорметан/ацетонитрил/вода использовались в качестве подвижной фазы для градиентной элюляции, и Один образец был обнаружен через 16 мин [30]. "Цианотек&"#39; метод определения содержания гематококковой плювиалисы заключается в извлечение пигмента, а затем в его гидролизе для определения HPLC. Эта предварительная обработка с помощью гидролиза преобразует астаксантин эфиры в астаксантин, который преобразует смешанный компонент, содержащий астаксантин соединения, в обнаружение одного компонента астаксантин, что упрощает анализ HPLC, позволяет проводить точную количественную оценку и обеспечивает высокую повторяемость. Более подробная информация об условиях хроматографии обратного этапа астаксантина приводится в таблице 1.

3.3 метод HPLC-MS

Из-за разнообразия и сложности извлечения астакзантина и его эфирных производных обычные методы спектрофотометрии и HPLC не могут выявить различия между различными молекулами астакзантина. Масс-спектрометрия позволяет лучше различать различные молекулы, используя различия в информации о массе и фрагментах между молекулами астаксантина-эфира, а затем проводить качественный и количественный анализ. Метод непосредственного измерения взятого образца пигмента с помощью HPLC/MS без обработки позволяет избежать деградации астаксантина в процессе сапонификации и может одновременно измерять астаксантин, астаксантин эфиры, другие каротеноиды и хлорофилл.

Имеет определенное применение при определении состава астаксантина и изучении метаболических механизмов астаксантина. Holtin et al. использовали LC-(APCI)MS для качественного анализа свободных астаксантиновых изомеров, астаксантиновых моноэфиров, астаксантиновых диетологов и лютейна в Haematococcus pluvialis [24]. Weesepoel et al. использовали эзиат и мадиль-тоф/тоф для проведения более детального анализа астакзантиновых эфиров в гематококковой плювиалисе, включая определение астакзантиновой эфирной цепи acyl и различия между СНГ и транс-изомерами [32]. Более подробная информация о хроматографической разбивке астаксантина и его эфирных производных приводится в таблице 1. Следует отметить, что низкая полярность каротеноидов и астаксантиновых эфиров затрудняет их ионизацию с использованием широко используемого источника ионизации ESI. Ионный источник ипки чаще используется для анализа астаксантиновых эфиров.

В настоящем документе рассматриваются и оцениваются современные методы извлечения, гидролиза и обнаруженияAstaxanthin в Haematococcus pluvialis- да. Содержание астаксантина измеряется непосредственно с помощью спектрофотометрии на длине волны 475 нм после экстракции с помощью дмсо. Содержание астаксантина быстро рассчитывается на основе линейного соотношения между содержанием каротеноидов, измеренным с помощью спектрофотометрии, и содержанием астаксантина, измеренным с помощью HPLC. Этот метод в большей степени способствует быстрому получению важных параметров в ходе исследований. После экстракции дмсо холестерин эстеразе используется для гидролиза, а HPLC используется для определения содержания свободного астаксантина, который может быть использован в качестве метода точного определения содержания астаксантина. Для различных целей обнаружения могут использоваться различные методы анализа, и сопоставление данных между различными лабораториями или методами должно корректироваться с учетом результатов после гидролиза извлеченной пробы и анализа ГПЛК.

Ссылка:

[1] кобаяши м., сакамото ю. синглет кислородной податливости астаксантиновых эфиров от зеленой алги Haematococcus pluvialis[J]. Биотехнологические письма,1999 год,21(4):265-269.

[2] нагиб у С. О. А. антиоксидант Мероприятия в области развития - астаксантина и По теме: Каротеноиды [J]. Журнал по теме В области сельского хозяйства и Пищевая химия,2000,48(4):1150-1154.

[3]Higuera-Ciapara I, Felix-Valenzuela L,Goycoolea F M. Astaxanthin: обзор ее химии и применения [J]. Критические обзоры в Food Science иNutrition,2006,46(2):185-196.

[4] cuelar-бермудес S P, агилар-эрнандес I, карденас-чавес D L, и др. экстракция и очистка высокоценных метаболитов

Из микроводорослей: основные липиды, астаксантин и фитобилибелки [J]. Микробная биотехнология,2015,8(2):190-209.

[5]Lin W C,Chien J T,Chen B h.определение каротеноидов в копытных креветочных скорлупах (Parapenaeopsis hardwickii) жидкостной хроматографией [J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,2005,53(13):5144-5149.

[6] Ни хуэй, хон цинлин, сяо анфэн и др. Производительность высокопродуктивного штамма астаксантина из Pichia pastis [J]. Китайский журнал биоинженерии, 2011, 27(7): 1065-1075.

[7] ким - да, виджаян Д, "правенкумар" R,et и Эл. Клеточная стенка Нарушение нормального функционирования И липид/астаксантин Экстракция из микроводорослей: хлорелла и гематококк [J]. Технология биоресурсов,2016,199:300-310.

[8] ю шаолей, ду вейчун, яо цяо и др. Технологические исследования по ферзиматическому гидролизу в сочетании с физическим методом обломки стенки свеклы гематококка [J]. Пищевая инженерия, 2016 (4): 38-40.

[9] цу юанган, лю лина, сюэ яньхуа и др. Экстракция астаксантина методом кавитации отрицательного давления [J]. Журнал северо-восточного лесного университета, 2007, 35(2): 59-60.

[10]Mendes-Pinto M M,Raposo M F J,Bowen Jet al. Оценка различных процессов разрушения клеток на encysted клетках Haematococcus pluvialis: влияние на восстановление astaxanthin и последствия для биодоступности [J]. Журнал прикладной филологии,2001,13(1):19-24.

[11] руен-нгам Ди, шотипрук A, "павсант" P. сравнение Соединенные Штаты америки 1. Извлечение В. методы работы для Восстановление после операции Соединенные Штаты америки astaxanthin  От Haematococcus pluvialis[J]. Наука и техника,2011,46(1):64 — 70.

[12] сарада р, видьявати р, уша д, и др. эффективный метод извлечения астаксантина из зеленой алги Haematococcus pluvialis[J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,2006,54(20):7585-7588.

[13] GB/T 31520-2015. Определение астакзантина в гематококковой плювиалисе-жидкостный метод хроматографии [п]. Китай, 2015 год.

[14] Юань й. п., чэнь ф. хроматографическое отделение и очистка трансастаксентина от экстрактов гематококковой плутовиалис [J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,1998,46(8):3371-3375.

[15] Сунь вэйхонг, сяо ронхуй, ленг кайлян и др. C30- обратная фаза высокопроизводительная жидкостная хроматография метод определения астаксантина в Haematococcus pluvialis [J]. Журнал аналитического тестирования, 2010, 29 (8): 841-845.

[16] [16] ли и, мяо F, генг. Тем не менее Al. Точная информация B. количественная оценка - астаксантина Из российской федерации Haematococcus  В общем и целом 1. Выписка Спектрофотометрически [J]. Китайский журнал океанологии и лимнологии,2012,30(4):627-637.

[17] Чжоу цзиньке, ли цзиньхуа, джи фахуан и др. Исследование нового ферзиматического метода извлечения астакзантина из плавиалиса Haematococcus [J]. Китайская материя медика, 2008, 31(9): 1423-1425.

[18] Seely G R,Vidaver W E,Duncan M j. подготовительное и аналитическое извлечение пигментов из коричневых водорослей с диметилсульфоксидом [J]. Морская биология,1972,12(2):184 — 188.

[19] буссиба - с, воншак А. астаксантин B. накопление запасов in  В настоящее время - зеленый цвет Организация < < алга > > Haematococcus  Плювиалис [J]. На территории предприятия и  Клеточная физиология,1991,32(7):1077-1082.

[20]Orosa M,Franqueira D,Cid A, и др. анализ и усиление накопления астаксантина в Haematococcus pluvialis [J]. Биоресурсная технология,2005,96(3):373-378.

[21]Boussiba S,Bing W,Yuan J P,et al. Изменения в профиле пигментов в зеленой алге Haeamtococcus pluvialis подвержены воздействию экологических нагрузок [J]. Биотехнологические письма,1999,21(7):601-604.

[22]Breithaupt D e. идентификация и количественная оценка астаксантиновых эфиров в креветках (Pandalus borealis) и микроводорослях (Haematococcus) Плавиалис на подходе В жидком состоянии 3. Хроматография масса 1. Спектрометрия Использование программного обеспечения Отрицательный результат: 0 ion  В атмосфере Химическая ионизация под давлением [J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,2004,52(12):3870-3875.

[23]Miao F P,Lu D Y,Li Y G, и др

Химическое ионизирующее масс-спектрометрия атмосферного давления [J]. Аналитическая биохимия,2006,352(2):176 — 181.

[24] холтин - кей, кюнле - м, ребейн J,et и  Al. Определение фактов Соединенные Штаты америки astaxanthin  and  astaxanthin  esters  in  В настоящее время  Микроводоросли Haematococcus pluvialis с LC-(APCI)MS и характеристики преобладающих изомеров каротеноидов с помощью спектроскопии NMR [J]. Аналитическая и биоаналитическая химия,2009,395(6):1613 — 1622.

[25] Чэнь синкай, хуан вейгуан, оуян цинь. Сапонификация астаксантиновых эфиров и очистка и отделение свободного астаксантина от Haematococcus pluvialis [J]. Журнал фучжоу университета (издание естественных наук), 2005, 33 (2): 264-268.

[26] Юань й. п., чэнь ф. гидролиз кинетиксофастаксантинестеры и стабильность астаксантина гематококковой плавиалиса во время сапонификации [J]. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,1999,47(1):31-35.

[27] жао и, гуан ф, ван г и др. Журнал Food Science,2011,76(4):C643-C650.

[28]Jacobs P B,Leboeuf R D McCommas S A, и др. Сравнительная биохимия и физиология b-биохимия & Молекулярная биология,1982,72(1):157 — 160.

[29] Чжан хюимин, ян цзяньцян и др. Быстрый метод определения содержания астаксинтина в Haematococcus pluvialis [J]. Исследования и разработки в пищевой промышленности, 2016, 37(12): 125 — 128.

[30] Юань й. п., чэнь ф.н. Идентификация астаксинтиновых изомеров в гематококке лакустрис с помощью обнаружения HPLC- фотодиодов [J]. Методы биотехнологии,1997,11(7):455-459.

[31]Peng J,Xiang W,Tang Q,et al.Comparative analysis of astaxanthin and its esters in the mutant E1 of Haematococcus pluvialis and other green водоросли by HPLC with a C30 column[J]. Наука в китае серия C-Life Sciences,2008,51(12):1108-1115.

[32]Weesepoel Y,Vincken J- p,Pop R M, и al.Sodiation как инструмент для повышения диагностической ценности MALDI-TOF/TOF-MS спектров сложных astaxanthin эфирных смесей Haematococcus pluvialis[J]. Журнал масс-спектрометрии,2013, 48(7):862-874.