Как использовать папин порошок в поле питания?

Папайн, протеаз фермент, полученный из свежего латексаНезрелые плоды папайи (Carica papaya), представляет собой эндопептидазу, содержащую сульфидрил (-SH) пептидные цепи. В нем представлены мероприятия по протеазе и эстеразе с широкой спецификой, эффективно гидролизирующие животные и растительные белки, пептиды, эфиры и амиды. Он также имеет синтетические функции, способные синтезировать гидролизаты белка в белкоподобные вещества. В промышленности используется папайн, как правило, неочищенный мульти-фермент системы. Известно, что папайн, получаемый путем сушки папайи латекс, содержит как минимум четыре основных типа фермента: папайн, чимопапайн, папайн протеиназ Ω (папайя протеиназ Ω) и чимопапайн м (чимопапайн м) [1], среди которых чимопапайн имеет самое высокое содержание, на его долю приходится 45% растворимых белков.

Папин очень растворим в водеИ глицерол, образующий бесцветные или бледно-желтые растворы, иногда появляющиеся молочно-белыми; Он практически нерастворим в органических растворителях. Его оптимальный показатель pH составляет 5,7 (как правило, он эффективен в пределах от 3 до 9,5) и остается активным в нейтральных или слегка кислотных условиях; Оптимальная температура 55-60 градусов (обычно эффективная от 10 до 85 градусов), с высокой теплостойкостью, оставаясь активной даже при 90 градусах; Он сдерживается окислителями и активируется понижающими агентами.

1 процесс извлечения папайна

1.1 традиционные методы извлечения в прошлом

Самым примитивным методом извлечения папайна был метод сушки, который предусматривал добавление защитного вещества в папайю целлюлозу, центрифугирование целлюлозы, сбор сверхъестественного вещества и его сушку в принудительной сушильной печи с 55-60 градиентом. Затем сухой материал был заготовлен к употреблениюСырые ферменты- да. Yi et al. [2] получили доходность фермента 23,1% с помощью этого метода, но это было неблагоприятно для сохранения ферментной активности, с ферментной активностью всего 0,16 × 10⁵ U/g, и чистота продукта была относительно низкой.

В настоящее времяДобыча папайнаКроме того, широко изучался метод выпадения таниновых осадков. Yi et al. [2] извлекли папайна с помощью этого метода. Во-первых, соку папайи была центрифуга, и раствор растворенного таннина медленно добавлялся к супернатанту, постоянно двигаясь, пока концентрация таннина в растворе не достигла определенного уровня. Затем раствор был разрешен выстоять, чтобы ускорить комплекс таннин-фермент, pH был скорректирован, и осадок был высушен вакуумом, чтобы получить фермент продукта. Результаты показали, что этот метод дал низкую доходность фермента всего 7,3%, но активность фермента была относительно высокой на уровне 3,53 градиента 10 градиента/г. Однако этот метод связан с такими проблемами, как загрязнение окружающей среды.

1.2в настоящее время широко используемые методы извлечения

В настоящее время для разделения и извлечения папайна широко используются методы ультрафильтрации, флоскуляции и выпадения соленых осадков.

1.2.1 метод ультра фильтрации для извлечения папайна

Тан цзин и др. [3] использовали ультра-фильтрационную технологию для отделения папайна. Во-первых, были очищены и обработаны полые ультра-фильтрационные мембраны, затем ультра-фильтрация была проведена под контролируемым давлением и скоростью потока.Папин-это макромолекулярное веществоЭто сохраняется при ультра фильтрации, в то время как вода и небольшие молекулярные примеси проходят через мембрану, тем самым обеспечивая разделение и очистку. Экспериментальные результаты показали, что активность папайна после ультра фильтрации была в 1,22 раза выше, чем до ультра фильтрации, а содержание белка в 2,8 раза выше, чем до ультра фильтрации, что указывает на повышение чистоты папайна после ультра фильтрации. Однако, поскольку папайн является макромолекулярным веществом, он, как правило, накапливается на мембранной поверхности во время ультра фильтрации, вызывая поляризацию концентрации и постепенно снижая скорость ультра фильтрации, тем самым влияя на урожайность фермента.

1.2.2 метод выпадения соленых осадков для извлечения папайна

Ван либин и др. [4] ранее использовались осадки сульфата аммония дляОтдельно от папы- да. В сыром ферменте для соления был добавлен раствор сульфата аммония при определенной концентрации, за которым последовала регулировка pH, центрифуга для сбора осадка, сушка и получение фермента. Экспериментальные результаты показали, что папен, подготовленный с помощью этого метода, имеет относительно высокую чистоту, при этом удельная активность фермента составляет 1184 U/ мг, что делает его пригодным в качестве косметического ингредиента. Однако этот метод использует большое количество соли, увеличивая содержание золы в ферменте и одновременно снижая активность папайна [5]. Таким образом, метод соленых осадков не является идеальным методом для извлечения папайна.

1.2.3 метод флокуляции для отделения и очистки папайна

Метод флокуляции предполагает добавление определенного соединения вЭкстракт воды из латекса папаина, который образует нерастворимые комплексы с папайном, в результате чего фермент осаждается и отделяется от раствора. Он Jiqin [6] и др. изучали очистку папайна с использованием технологии флокуляции. Экспериментальные результаты показали, что при соответствующих условиях, flocculation лечение может достичь урожайности 95-97% для папайна на этом этапе. Тем не менее, этот метод имеет низкую конкретность, в результате чего папин с низкой чистотой и высоким содержанием примесей.

1.3 новые технологии добычи папайна

1.3.1 ультразвуковое извлечение папайна

Ультразвуковая экстракция, как новый метод экстракции, широко применяется в экстракцииАктивные компоненты из натуральных растений- да. Кавитационный эффект, вызываемый ультразвуковыми волнами [7], усиливает растворитель#39; проникновение s в клеточные стенки усиливает перемещение массы между внутренней и внешней поверхностью клетки и разрушает клеточные стенки, тем самым способствуя высвобождению внутриклеточных компонентов и улучшая процесс экстракции [8]. Эффект микроструи, формируемый ультразвуковыми волнами, также является важным фактором повышения эффективности экстракции.

Сяо гипин [9] ранее использовался для ультразвуковой экстракцииВытащи папайна из папайи- да. Свежий папайя был выбран, промыт, разрезан на куски, и раздавлен. Затем фруктовая целлюлоза была смешана в пасту. Целлюлоза подвергалась ультразвуковой обработке в особых условиях, за которой следовали центрифугация, очистка и фильтрация. Затем супернатант был сконцентрирован посредством ультра-фильтрации для сбора проб фермента. Результаты показали, что при ультразвуковой мощности 300 вт, времени ультразвуковой обработки 200 с и доли целлюлозы плода в 30% активность ферзима в 1,71 раза превышала активность необработанного образца.

В настоящее времяСырое ферментное решениеПолученный с помощью ультразвукового экстракционного процесса имеет низкое содержание фермента и содержит значительное количество примесей. После предварительной очистки и концентрации через разделение мембран требуется дальнейшая очистка. Это требует дальнейшего изучения для повышения активности фермента и чистоты.

1.3.2 мембранная хроматография аффинити для экстракции папайна

Мембранная хроматография аффинити — это новая технология разделения и очистки биоакромолекул, разработанная в конце 1980 - х годов. Она сочетает разделение мембраны с разделением по аффинити, тем самым объединяя характеристики как разделения мембраны, так и разделения по аффинити. Nie Huali et al. [10] использовали нейлоновую мембрану в качестве субстрата, модифицировали ее поверхность с помощью читосана, чтобы уменьшить неспецифическую адсорбцию, и соединили краситель ligиCibacron Blue F3GA, чтобы получить новый тип материала аффинити мембранной хроматографии, который затем был использованОтдельно от папы- да. Результаты показали, что мембрана аффинити продемонстрировала отличные хроматографические характеристики с высокой адсорбцией папайна (235,3 мг/г). Используя эту мембрану аффинити для отделения и очистки папайя от порошка, коэффициент очистки достиг 46,5 раза.

По сравнению с традиционной хроматографией мембранной сепарации и аффинити, мембранная хроматография аффинити имеет не только такие преимущества, как высокий коэффициент очистки, низкое падение давления, короткое время анализа и низкая вероятность денатурации биомолекул во время сепарации, но и позволяет ускорить скорость подачи. Кроме того, его легче масштабировать для крупномасштабной очистки и разделения по сравнению с хроматографией схожести столбов [11].

1.3.3 раздел 1.3.3 Экстракция папайна с использованием двухфазной экстракции

Двухфазная экстракция-это метод, при котором используются различия в коэффициентах распределения между двумя нестираемыми фазами экстракции веществ. Сароте N et al. [12] использовали двухфазный метод извлечения папайна, и результаты показали, что двухфазная система, состоящая из 8% полиэтиленгликоля и 15% сульфата аммония, дает наилучшие результатыЭффективность извлечения папайна, с удельной активностью фермента 1659 U/ мг и доходностью 86,2%.

Бифазное извлечение воды дает такие преимущества, как высокая урожайность целевого продукта, простота непрерывной эксплуатации, отсутствие остаточных органических растворителей и экономичные процессы разделения. Он должен быть где-то здесьПодготовка к выпуску папайна- либо: Однако до настоящего времени такие доклады в китае не публиковались. По мере постоянного развития прикладных программ papain требования к чистоте папайна также возрастают. Поэтому настоятельно необходимо разработать более конкретные методы подготовки папайна. Большое значение имеет разработка двухфазных технологий добычи в качестве эффективного метода разделения и добычи высокочистого папайна.

Короче говоря,Методы экстракции папайнаКак правило, не являются типичными и обычно предполагают сочетание таких методов, как соленые осадки, фильтрация, центрифугация, концентрация, кристаллизация и сушка. Процесс экстракции может быть оптимизирован на основе физико-химических свойств фермента для максимального использования ресурсов и достижения максимальных экономических выгод.

2  Иммобилизация папайна

Из-за высокой стоимости иНевоспроизводимость папайнаИсследователи исследовали подготовку иммобилизованного папайна. Обездвиженный папин может избежать инактивации в кислотных, щелочных и органических средах, что позволит многократно использовать фермент и снизить производственные издержки. Общие методы иммобилизации включают адсорбцию, перекрестное соединение и инкапсуляцию.

2.1 метод адсорбции

Метод, при которомАдсорбирующие ферменты или ферменты, содержащие ферментыБактериальные клетки на поверхности твердого адсорбента для иммобилизации ферментов называют адсорбцией. Широко используемые адсорбенты включают активированный уголь, оксид алюминия, диатомную землю, пористую керамику, пористое стекло, силикагель и карбоксилапатит.

Фан хуан и др. [13] использовали пористые керамические мембраны, обработанные фосфатно-буфетным раствором, в качестве носителей иммобилизованных ферментов и использовали физическую адсорбцию для иммобилизации папаина. Результаты показали, что при концентрации фермента раствора 1,0-2,0 мг/мл, pH 7,0, и фермент был иммобилизован в течение 2 часовМаксимальная активность ферментаДостигла 111,1 U/g с восстановлением активности 57,9% и периодом полураспада 54 суток.

2.2 метод перекрестной связи между перевозчиками

Метод перекрестной связи предполагает использование бифункциональных реагентов для стимулирования перекрестной связи между ферментными молекулами или между нимиФерменты молекул и твердофазных носителейПодготовка иммобилизованных ферментов. Широко используемые бифункциональные реагенты включают глутаралдегид и гексаметилэтетрамин.

Гао минксия и др. [14] использовали читосан в качестве носителя и глутаралдегид в качестве связующего агента для иммобилизации папайна. Результаты показали, что оптимальными условиями для читосан-иммобилированного папайна являются: концентрация читосана 2,5%,Загрузка фермента0,3 г/г носителя, время реакции 6 часов, температура 15 градусов, pH 7,5, и скорость восстановления фермента 38,98%. Иммобилизованный фермент сохранил более 50% своей активности после пяти повторных применений.

2.3 метод встраивания

Метод встраивания ферментов или ферментосодержащих бактериальных клеток в пористые носители для иммобилизации ферментов называется методом встраивания.

Джин фэн [15] использовал метод интродукции альгината крахмала-натрия для иммобилизации папайна, и результаты показали, что оптимальные условия для этогоГотовлю обездвиженного папаинаПри концентрации крахмала в микропорах - 4%, альгината натрия - 3% и гравитационной концентрации CaCl - 5,5%. В этот момент оптимальное значение pH для иммобилированного папайна составляло 5,7, а оптимальная температура - 72 градуса. Его тепловая стабильность, эксплуатационная стабильность и механическая прочность были в различной степени улучшены при низких эксплуатационных затратах, что делает его пригодным для промышленного применения.

2.4 другие новые методы

В последние годы исследователи постоянно разрабатывают новые средства и методы иммобилизации, достигая многообещающих результатов. Zou Zhechang et al. [16] обездвиженный папаин с использованием1. Силика 1Мезопорозный пенопласт как носитель. Результаты показали, что оптимальная температура реакции иммобилизованного папайна была на 10 градусов выше, чем у свободного фермента, оптимальный pH смещался на 0,5 единицы в направлении щелочи, а активность фермента сохранялась на уровне 65,1%. Лин ин и др. [17] химически модифицированный спиртный лигнин с высокой температурой кипения и энзиматически гидролизированный лигнин для повышения их гидрофилистичности, синтезирующий новые спиртные лигнин с высокой температурой кипения лигнин фенол (HBS lignin phenol) и лигнин аминол производные фенола, и исследовал иммобилизацию папаина с использованием этих материалов. Результаты показали, что скорость восстановления активности папена при адсорбировании ферментно модифицированным лигниным аминолом и HBS лигниным фенолом превысила 50%, что указывает на его потенциал в качестве превосходного носителя иммобилизованных ферментов.

3 в настоящее время применение папайна в пищевой промышленности

3.1 в качестве мясоискателя

С повышением уровня жизни, после решения проблемы продовольственной безопасности, люди постепенно стали предъявлять более высокие требования к населениюКачество и текстура мяса- да. Мясо старого домашнего скота и птицы при приготовлении имеет грубую и твердую текстуру. Однако, когда добавляется мясной порошок, мясо становится нежным и мягким.

Один из основных компонентовМясоискатель-это папин, которая представляет собой цистеинную протеазу, способную разлагать белки в мышечных волокнах и соединительной ткани [18]. Он разрушает миозин и коллаген на небольшие пептиды или даже аминокислоты, в результате чего мышечные волокна и сухожилие разрываются, делая мясо нежным, гладким и хрустящим. Это упрощает структуру белка, делая его легче переваривать и поглощать. С другой стороны, тендеризаторы работают наиболее эффективно в процессе отпаривания или кипения при высоких температурах. Папайн очень устойчив к жаре, оставаясь активным даже при температуре 90 градусов, что делает его идеальным для производства тендеризирующего порошка.

Лэй Changgui et al. [19] использовали свежую говядину в качестве сырья для изучения последствийПапин на индексе фрагментации мышечного волокна(MFI) и сила сдвига говядины. Результаты показали, что раствор папайна с концентрацией 0,007% оказывает наилучшее воздействие на говядину, главным образом благодаря тому, что папайн способствует расщеплению z-линий, что приводит к значительному увеличению индекса фрагментации мышечного волокна (MFI) и значительному снижению силы сдвига при длительном хранении.

- б. М. навина и др. [20] исследовали тендеризирующее воздействие различных растительных протеазов на мясо буйволов. Результаты показали, что у мяса буйвола, обработанного папайном, наблюдалось значительное увеличение миофибрилляраРастворимость в белкахИ значительное снижение значений силы сдвига.

Благодаря своей превосходной способности гидролиза белка, папайн может применяться в различных областях. В морском рыболовстве and Рыба низкой ценностиНа их долю приходится значительная доля. Если они не будут надлежащим образом использованы, это приведет к значительным потерям. Мы можем использовать папайн для производства концентрированного гидролизированного белка, который превосходен по сравнению с цельной рыбой или рыбными белковыми концентратами, отличающимися хорошей растворимостью в воде, низким содержанием жира, низким содержанием золы и высоким содержанием белка. Папин также может быть использован для предотвращения браунтинга продуктов питания и восстановления остатков мяса от животных костей во время убоя [21].

3.2 как средство повышения качества пива

В основном используется дляПовышение качества пива- да. Папайн может гидролизировать белки в пивом, частично гидролизировать некоторые сформированные комплексы, производить больше пептидов или аминокислот, обеспечивать высокую чистоту пива во время заморозки и улучшать вкус пива, оптимизируя состав и соотношение оригинальных пептидов и аминокислот, эффективно повышая качество пива. Согласно отчетам, добавление папайна при концентрации 0,08 мг /100 мл в пиво во время заморозки дает лучший эффект прояснения, увеличивая содержание свободной аминокислоты, снижая мутность на 68,75%, и увеличивая содержание свободных аминокислот, таких как треонин, валин и аргинин, увеличивая их в 8,2 раза, 0,2 раза и 1,1 раза, соответственно [22].

3.3 в качестве смягчающего средства для печенья

По вопросу об использованииПапа в печеньях и пирожкахМожет разрушать бедра, уменьшать прочность теста глютена, улучшать структуру крошки печенья, улучшать текстуру крошки и уменьшать степень дефектологии при повышении урожайности; Кроме того, это может уменьшить использование жиров и сахара. Подходит для производства высококлассных, средне-и низкокачественных печенек, выпечки и хлеба с различными вкусами [23].

3.4 используется для приправы

Компания Brewer' дрожжиЯвляется побочным продуктом пивной промышленности. Через действие папайна, ароматические дрожжи экстракт с богатым вкусом экстракт, который может быть приправлены для производства дрожжевого соуса приправы. Это является отличным приправы, повышая ценность и использование brewer' дрожжи.

3.5 используется в пищевой промышленности

Папин в основном используется вПищевые добавки для здоровьяПо двум направлениям: одним из них является пищеварительное средство, сформулированное в виде таблеток с кишечным покрытием для перорального введения с целью облегчения нарушений пищеварения; Другой заключается в разложении растительных и животных источников, содержащих специальные белки, в различные пищевые добавки. Фан фуйонг и др. [24] использовали папайн для гидролиза мяса моллюсков бафей, и результаты показали, что гидролисат содержал высокое содержание свободных аминокислот, приблизительно 923,0 мг /100 мл (триптофан не включен), при этом основные аминокислоты составляли 33,0%. Мясо из моллюска бафеи, после гидролиза составным протеазом и надлежащего состава, может быть использовано для производства богатой питательными веществами, ароматизированной морепродуктами пероральной жидкости с определенными преимуществами для здоровья.

3.6 применение в производстве кормов для домашних животных

Лечение и уходКорм для домашних животныхС папайн может уменьшить свою вязкость, улучшить текстуру, и повысить вкус. Кроме того, папайн обладает антольминтическими свойствами, и соком папайи можно использовать для удаления нематод из кишечника млекопитающих.

Кроме того, папайн может применяться в химической и фармацевтической промышленности. Например, добавление папайна в моющие средства, такие как порошок для стирки, может быстро удалить пятна крови и пятна пота из одежды. Кроме того, папайн может способствовать эффективной добычеКомпоненты традиционной китайской медицины, помогают в идентификации типов Rh крови, и используются для вспомогательного лечения опухолей.

Перспективы на будущее

В настоящее время папайн широко используется в пищевой промышленности, например, в СШАПроизводство мяса, пива и приправ- да. С повышением уровня жизни в китае люди все больше беспокоятся о продовольственной безопасности и питании. Papain может быть использован для производства безопасных и питательных продуктов, таких как пероральные жидкости с пользой для здоровья, которые имеют многообещающие перспективы рынка.

Кроме того, для удовлетворения растущего спроса на папайн в различных отраслях, особенно в соединенных штатахПродовольственная и фармацевтическая промышленность, исследования методов разделения и очистки папин с низкой стоимостью и высокой чистоты имеет большое значение. Поэтому проведение углубленных исследований технологии извлечения и разделения папайна для получения высококачественного папайна имеет важное практическое значение.

Ссылки на статьи

[1] Бернард п. о, Эндрю м. х, Дэвид дж.б., и др. Кристаллическая структура глицилэндопептидазы от Carica papaya: цистеинэндопептидаза необычной субстратной специфичности. Биохимия, 1995, 34: 13190 — 13195.

[2] йин, тан айхуан, лю нин и др. Исследование, посвященное процессу производства папайна [J]. Сельскохозяйственные науки гуйчжоу, 2000, 28(5): 24-25.

[3] тан цзин, чэнь цзюань, ся вэньшуй и др. Ультра-фильтрационное отделение папайна с деятельностью читиназы [J]. Продукты питания и оборудование, 2007, 23(6): 20-23.

[4] ван либин, чжан тао, ван минь. Разделение, очищение и характеристика высокой чистоты папайна [J]. Китайский журнал биохимических препаратов, 2006, 27(3): 159-162.

[5] мохамед а., ануар э. м., дельфина в. в., и др. Фракция и очистка ферментов, хранящихся в латексе Carica papaya [J]. Журнал хроматографии B, 2003, 790: 229-238.

[6] He Jiqin, Zhang Haide. Методы отделения и применение папайна [J]. Наука и техника о продовольствии, 2006, 10: 66 — 69.

[7] кн или рд, дзен кер м, хайнц V и др. Применение и потенциал ультразвука в пищевой промышленности [J]. Тенденции в области науки и техники о продовольствии, 2004 год, 15: 261-266.

[8] ван цзинь, хан тао, ли липин. Биологические последствия ультразвука и его применения в пищевой промышленности [J]. Журнал пекинского сельскохозяйственного колледжа, 2006, 21(1): 67-75.

[9] сяо гипин. Ультразвуковой экстракционный процесс и ферментативные свойства папайна. Журнал фуцзянского сельскохозяйственного и лесного университета, 2005, 34(3):318-323.

[10] ни хуали, чэнь тяньсян, чжу лимин. Подготовка нейлоновых мембран аффинити и их разделение и очистка папайна [J]. Мембранные науки и технологии, 2008, 28(1): 16-20.

[11] Guo W., Ruckenstein E. отделение и очистка консерадиш пероксидазы с помощью хроматографии мембранного аффинити [J]. Мембранная наука, 2003, 211: 101 — 111.

[12] Sarote N., Rajni H. K., Pawinee K. очистка папайна от Carica papaya latex: водная двухфазная экстракция по сравнению с двухэтапными соленовыми осадками [J]. Фермент и микробные технологии, 2006, (39)5: 1103 — 1107.

[13] фан хуан, гао сян ян, чжан хунли и др. Исследование по иммобилизации папайна на пористых керамических мембранах [J]. Журнал южно-китайского сельскохозяйственного университета, 2006, 27(4): 36-39.

[14] гао минксия, мяо цзинчжи, као чжэхонг и др. Исследование по извлечению полисахаридов бердока с использованием читина-иммобилизованного папайна [J]. Наука о еде, 2007, 28(9): 226 — 229.

[15] джин фэн. Изучение микропористого альгината крахмала-натрия иммобилизованного папайна. Пивоварение в китае, 2009, (7): 83 — 85.

[16] Zou Zechang, Wei Qi, Na Wei et al. Исследование на силикатных мезопорных пеноматериалах обездвиженных папаин. Журнал неорганических материалов, 2009, 24(4): 702-706.

[17] лин ин, фан ран, чэн сяньсу. Исследование по адсорбции трех протеазов производными лигниновых продуктов [J]. Журнал химической инженерии биомассы, 2009, 43(2): 6-10.

[18] цай сяоуэн, хан луци, цзян цянь юн. Исследование по вопросу об использовании порошка для тендеризации (papain) [J]. Исследования мяса, 2005 (10): 42-44.

[19] лэй чанги, Мэн южу, СИ хюпин. Воздействие хлорида кальция, фосфатов и папайна на мфу и носовую силу говядины [J]. Мясная промышленность, 2009, 2: 23 — 25.

[20] б.м. навина, с.к. мендиратта, А.С.Р. анджаниулу. Тендеризация буйвола с использованием растительных протеазов Cucumis trigonus Roxb (Kachri) и Zingibero cinale roscoe (рыжий rhizome) [J]. Наука о мясе, 2004, 68: 363 — 369.

[21] ян сан, Дэн шангуи, цинь сяомин. Подготовка и антиоксидантная и антибактериальная деятельность низкоценных рыбных белков пептидес-кальциелатов [J]. Наука о еде, 2008, 29(1): 202 — 206.

[22] шэнь юэ. Обзор исследований и прикладных программ папайн [J]. Наука и техника, 2008, 11: 313 — 314.

[23] сюн цюньчао, сюй дечан. Прогресс в применении папайна [J]. Сахарная свекльная промышленность китая, 2008, (1): 43-45.

[24] фанг фуюн, мяо янли, сонг вондинг. Разработка гидролизового процесса для составного фермента из валкообразных бивентильных корпусов и формирование функциональной пероральной жидкости [J]. Наука о еде, 2009, (18): 412 — 415.