5 методов производства глутатиона

Методы производства глутатиона включают экстракцию, химический синтез, биосинтез, ферменты и ферментацию. Ферментация относится к использованию микробного метаболизма для преобразования недорогих питательных веществ в глутатион. Микроорганизмы, используемые в ферментации, легко выращиваются, питательные вещества недороги и легко получить, а процесс работы проста, поэтому, основываясь на вышеперечисленных преимуществах, ферментация стала наиболее распространенным методом производства глутатиона.

1. Экстракция растворителей

Классическим методом производства глутатиона является экстракция, при которой растворителями могут быть кислотные органические растворители, H2O, эфиры, энолы и смеси этих компонентов в различных пропорциях. Экстракция является оригинальным методом производства глутатиона, который использует разную растворимость глутатиона в двух различных растворителях для экстракции глутатиона [1]. Метод экстракции используется главным образом для разделения и экстракции растительных и животных тканей, используя метод экстракции и выпадения осадков, из-за сложности получения сырья и крайне низкого содержания внутриклеточного глутатиона в растительных и животных тканях, поэтому метод экстракции органических растворителей не имеет большого значения в практическом применении глутатиона и не получил широкого применения [2].

2. В. химический синтез

Производство глутатиона химическим синтезом [3] — химическая реакция, при которой глутатиновая кислота, глицин и цистеин химически конденсируются до образования глутатиона, который в основном используется при производстве глутатиона на ранней стадии. В настоящее время производственный процесс является более зрелым, но этапы являются сложными, операционный процесс сложным, а тривиальная эффективность низкая. Он синтезирует рацемат глутатиона, который необходимо смешивать с рацетом глутатиона с помощью оптических разъедящих реагентов. Образование диастереоизомеров с различными физико-химическими свойствами для расщепления в конечном счете приводит к трудностям разделения и низкой чистоты продукта, низкой эффективности производства и легко вызвать загрязнение окружающей среды. Поэтому он ограничивает широкое применение этого метода.

3. Метод биосинтеза

Существуют две основные формы биосинтеза глутатиона: ферментация и фермент метод. Общая точка зрения заключается в Том, что должна быть хорошая производительность штамма клетки, а затем использовать его более активную ферментную систему для синтеза глутатиона в мягких условиях; Самое большое отличие заключается в Том, что ферментация должна обеспечивать только питательные вещества, необходимые для микробного роста и обмена веществ, в то время как энзиматический метод должен обеспечивать большое количество прекурсоров аминокислот и атф для накопления внутриклеточного глутатиона [4].

Для биосинтеза глутатиона требуются прекурсоры аминокислот, главным образом глу, сгэ и гли. Meister et al. [5] предложили ступенчатый цикл, показанный на рис. 1, в котором подчеркивается центральная роль глютатиона в поглощении аминокислот. В биосинтезе глутатион синтезируется последовательным действием двух зависящих от атф лигазов, а именно: гравитационно-глутамилцистеинового синтеза (ГКТ) и глутатионового синтеза (гс)[6].

Рис.1

После биосинтеза начинается деградация глутатиона. В этом цикле разложение осуществляется методом транспептидазы (ГГТ)-единственным ферментом, который, как известно в то время, разлагает глутатион, - который ведет транспептидическую деятельность, связанную с передачей групп грава-глутамиля аминокислотам для формирования аминокислот грава-глутамила. Деятельность GGT, требуемая в рамках цикла γ-glutamyl, представляет собой в первую очередь транспептидазу и, следовательно, фермент ' действия s в основном транспептидические, включая перенос аминокислот для образования аво-глютамильных аминокислот, которые в конечном итоге переносятся через мембраны в качестве аво-глютамильных аминокислот. Это было первоначальное понимание биосинтеза глутатиона и его метаболизма.

В более позднем исследовании Bachhawat [53] первоначально сделал вывод о Том, что граво-глутамиловый цикл не только с точки зрения функциональной роли белков транспортерных аминокислот, но и с точки зрения описания синтеза и деградации глутатиона. Это также справедливо в свете новых данных о деградации глутатиона. По мере изучения и обобщения этих новых выводов возник новый цикл, который мы называем «глутатионным циклом [7]», как показано на рис. 2.

Рис.2 цикл глутатиона

В цикле глутатиона первыми двумя шагами является биосинтез глутатиона. Биосинтез осуществляется двумя последовательными ферментами, GCL катализирует образование грава-глутамилциштейна от глутамата и циштейна в зависимости от атп реакции. Затем GS катализирует вторую зависимую от атп реакцию грава-глутамилциштейна и глицина. Затем образуется глутатион. Он может быть разлагается цитоплазматическим ChaC семейством глутатионов-специфичных разлагающих ферментов (γ-GCT) [13], образуя 5- гидроксипролайн и цистеинилглицин. Впоследствии 5- гидроксипролайн и цистейнилглицин выводятся соответственно 5- гидроксипролайн и цистейнилглициновые пептидазы для формирования глу, Cys и Gly, которые при необходимости могут быть извлечены обратно для синтеза глутатиона. Глутатион формируется посредством биосинтеза и может также образовывать GSSG, с помощью которого он балансирует и определяет среду redox [8].

4. Энзиматический синтез глутатиона

Под энзиматическим синтезом понимается использование ферментов для катализации синтеза глутатиона из трех аминокислот. В этом ферментно-катализируемом методе используются три прекурсора аминокислот в качестве субстратов, атф в качестве функционального вещества, гравитационно-глутамилцистеин-синтезаза (глутатион I) и глутатионный синтезаз (глутатион II), кофакторы (Mg2+) и надлежащая pH-среда. В настоящее время сообщается о многочисленных исследованиях по ферментативному синтезу глутатиона, однако в последние годы основное внимание уделялось синтезу двух ферментов.

Xing Zhang et al.[9] синтезировали глютатион энзиматически путем построения многоступенчатой реакции двух ферментов (полифосфат-киназа (PPK) и глютатион-бифункциональный синтез (глютатион-F)) с использованием полифосфата в качестве источника энергии и оптимизировали экспрессионные условия комбинированных ферментов (ГФК и глютатион-F), что привело к получению глютатиона в объеме 58± 3,3 mmol/L. Также оптимизирован фермент, синтезированный глутатионом путем ферментативного синтеза PPK и глутатиона F. Выход глутатиона достиг 58 ° / л. Ферментативное производство глутатиона характеризуется высокой скоростью преобразования и мягкими условиями. Основными факторами, сдерживающими производство фермента, являются отсутствие поставок СПС и высокие цены на него.

В этом исследовании чэнь ян и др. Векторы pET28a-glutathione f и pET28a-ppk были построены в системе, содержащей полифосфат-киназу и преобразованы в E. coli BL21, соответственно. Для возникновения реакции требуется не менее 20 ммоль атф, после чего адп генерируется и регенерируется для получения атп для непрерывного энергоснабжения реакции, а скорость преобразования субстрата может достигать 68,7% после 22 ч. Реакция осуществляется в системе, содержащей полифосфат-киназу.

5. Производство и продажа Глутатиона методом ферментации

Ферментация относится к использованию микробного метаболизма для преобразования недорогих питательных веществ в глутатион. Ферментация стала наиболее распространенным методом производства глутатиона из-за простоты выращивания микроорганизмов, наличия питательных веществ и простоты работы [11].

В настоящее время дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, baker' дрожжи s и псевдодомы syringae являются наиболее широко используемыми микроорганизмами для производства глутатиона, но большинство дрожжей имеют относительно низкое содержание глутатиона. Таким образом, выбор и разведение превосходных штаммов дрожжей, разведение диких штаммов мутацией и генной инженерией, а также оптимизация и регулирование культурных условий в процессе ферментации являются горящими темами в исследовании метода ферментации. Канг и др. [12] отдельные сушеные сахаромицевые церебрышки из нурука, содержащие 25,53 грава/мг глутатиона. Нисамедтинов и др. [13] показали более высокие уровни глутатиона в маргаритах, ферментированных отдельными штаммами дрожжей. Случайный мутагенез, вызванный уф-облучением штаммов диких Saccharomyces cerevisiae, привел к молекулярному механизму избыточной аккумуляции глутатиона. Мутанты накапливали глутатион в концентрациях, в несколько раз превышающих их материнский штамм дикого типа.

Было показано, что добавление трех прекурсоров аминокислот в дрожжевые культуры в определенной степени повышает уровень глутатиона. Пакетное добавление глутатиона в Saccharomyces cerevisiae является более ценным, чем последовательное добавление цистеина в качестве метода поощрения производства глутатиона Wen S et al.[15] исследовали двухступенчатая стратегия добавления в качестве подходящей стратегии добавления аминокислот: на первом этапе цистеин добавлялся после 2 часов инкубации, а затем после 7 часов добавлялись три аминокислоты (глютаминовая кислота, глицин и серин). В культуре шейных фляг внутриклеточный глутатион был на 55,2% выше, чем без добавления трех аминокислот.

Ван дахуи и др. [16] исследовали влияние l-цистеина и l-метионина на синтез глутатиона в культурах, соответственно, входящих в партии и в дополнение к потоку, и показали, что l-метионин повышает способность дрожжевых клеток синтезировать глутатион на стадии роста, в то время как l-цистеин значительно увеличивает содержание внутриклеточного глутатиона в дрожжевых клетках на стадии почти полного прекращения роста.

Исходя из этого, мы предложили стратегию добавления аминокислот в дрожжевые клетки на двух этапах роста, в результате чего выход глутатиона составил 1247,1 мг/л, а содержание внутриклеточного глутатиона - 24,1 мг/г. Результаты экспериментов были дополнительно улучшены. Ван шуо и др. [17] показали, что добавление глюкозы, валина и l-циштейна в культурологическую среду в процессе ферментации увеличило общий глу

Справочные материалы:

[1] чжоу сюцинь. Специальные производные аминокислоты -- глутатион [J]. Fermentation Science and Technology Newsletter, 2007, 36(2): 50-51.

[2] хуан цзинчунь, лян либинг. Способ производства сокращенного глутатиона и его применение [J]. Наука и технологии легкой промышленности, 2013, 1: 11 — 12.

[3] ван дахуэй, вэй гонюань. Перспективы применения глутатиона и текущее состояние производственных исследований [J]. Химическая и биологическая инженерия, 2004, 3: 10 — 12.

[4] чэнь цзянь, вэй гонюань, ли инь, цзоо гочэн. Производство глутатиона путем микробной ферментации [J]. Журнал вьюси университета легкой промышленности, 2004, 5: 104 — 110.

[5] орловский м., майстер а. гамма-глутамильский цикл: возможная транспортная система аминокислот. Прок натл акад ски у са. Ноябрь 1970 года; 67(3): 48-55.

[6] каур а, гаутам р, сривастава р и др. ChaC2, фермент для медленного оборота цитозолического глутатиона. J биол чем. Январь 2017; 292(2): 638-651.

[7] Bachhawat AK, Kaur A. Glutathione деградация. Антиоксидный редокс сигнал. Ноябрь 2017 года; 27(15): 1200-1216.

[8] бачхават ак, ядав с. глутатионный цикл: глутатионный метаболизм за грау-глутамиловым циклом. Июл 2018 года; 70(7): 585-592.

[9] чжан X, цуй XW, ли цл и др. Ферментативное производство глутатиона на основе системы регенерации энергетического цикла [J]. Journal of East China Science and Technology (Natural Science Edition), 2020, 46(5): 119-124.

[10] чэнь ян, у цён, тан тяньвэй. Комбинированная регенерация СПС для ферментативного синтеза глутатиона [C]. 2013 год ежегодное собрание китайского общества инженеров-химиков. 2013 год.

[11] чжао хон лин, гао ян, инь чжифэн и др. Прогресс в производстве сокращенного глутатиона путем ферментации [J]. Журнал медицинского колледжа чэнде,2013, 30(6): 516-518.

[12] Kang S H, Kim H R, Kim J H, et al. Идентификация штаммов дикого дрожжа и анализ их уровней грау-глюкан и глутатион для использования в пивоварении макгеолли. Майкобиология. Декабрь 2014; 42(4): 1-7.

[13] нисамедтинов I, кеввай к, оромец к и др. Метаболические изменения, лежащие в основе более высокого накопления глутатиона в saccharomyces cerevisiae Appl Microbiol Biotechnol. 2011 фев.; 89(4).

Февраль 2011 года; 89(4): 29-37.

[14] хара к и, кирияма к, инагаки а и др. Совершенствование производства глутатиона путем метаболической инженерии пути ассимиляции сульфата сахаромициных церебрысий. Appl Microbiol Biotechnol. 2012 Jun; 94(5): 3-9.

[15] Wen S H, Tao Z, Tan T. использование аминокислот для увеличения производства глутатиона в Saccharomyces cerevisiae. 35(6-7): 501-507.

[16] ван д, ни м, вей ги. Высокопродуктивный метод ферментации глутатиона, основанный на двухступенчатой аминокислотной добавке [J]. Наука о еде, 2017, 38(22): 22 — 27

[17] ван шуо, се юэву, чжан хуивен и др. Оптимизация ферментации, изоляции и очистки пониженного глутатиона [J]. Биотехнологический вестник, 2013(11): 180-185.

[18] ван хунги, Дэн чуня, тан хайтао и др. Влияние двух видов экзогенных стимулов на производство глутатиона путем ферментации отработанных пивных дрожжей [J]. Пищевая и ферментационная промышленность, 2014, 40(10): 54 — 57.