5 методов производства глутатиона

Методы производства глутатиона включают экстракцию, химический синтез, биосинтез, ферменты и ферментацию. Ферментация относится к использованию микробного метаболизма для преобразования недорогих питательных веществ в глутатион. Микроорганизмы, используемые в ферментации, легко выращиваются, питательные вещества недороги и легко получить, а процесс работы проста, поэтому, основываясь на вышеперечисленных преимуществах, ферментация стала наиболее распространенным методом производства глутатиона.

1. Экстракция растворителей

Классический метод:Производство глутатиона- экстракция, при которой растворителями могут быть кислотные органические растворители, H2O, эфиры, энолы и смеси этих компонентов в различных пропорциях. Экстракция является оригинальным методом производства глутатиона, который использует разную растворимость глутатиона в двух различных растворителях для экстракции глутатиона [1]. Метод экстракции используется главным образом для разделения и экстракции растительных и животных тканей, используя метод экстракции и выпадения осадков, из-за сложности получения сырья и крайне низкого содержания внутриклеточного глутатиона в растительных и животных тканях, поэтому метод экстракции органических растворителей не имеет большого значения в практическом применении глутатиона и не получил широкого применения [2].

2. В. химический синтез

Производство глутатиона химическим синтезом [3] — химическая реакция, при которой глутатиновая кислота, глицин и цистеин химически конденсируются до образования глутатиона, который в основном используется при производстве глутатиона на ранней стадии. В настоящее время производственный процесс является более зрелым, но этапы являются сложными, операционный процесс сложным, а тривиальная эффективность низкая. Он синтезирует рацемат глутатиона, который необходимо смешивать с рацетом глутатиона с помощью оптических разъедящих реагентов. Образование диастереоизомеров с различными физико-химическими свойствами для расщепления в конечном счете приводит к трудностям разделения и низкой чистоты продукта, низкой эффективности производства и легко вызвать загрязнение окружающей среды. Поэтому он ограничивает широкое применение этого метода.

3. Метод биосинтеза

Существуют две основные формы биосинтеза глутатиона: ферментация и фермент метод. Общая точка зрения заключается в Том, что должна быть хорошая производительность штамма клетки, а затем использовать его более активную ферментную систему для синтеза глутатиона в мягких условиях; Самое большое отличие заключается в Том, что ферментация должна обеспечивать только питательные вещества, необходимые для микробного роста и обмена веществ, в то время как энзиматический метод должен обеспечивать большое количество прекурсоров аминокислот и атф для накопления внутриклеточного глутатиона [4].

Для биосинтеза глутатиона требуются прекурсоры аминокислот, главным образом глу, сгэ и гли. Meister et al. [5] предложили ступенчатый цикл, показанный на рис. 1, в котором подчеркивается центральная роль глютатиона в поглощении аминокислот. В биосинтезе глутатион синтезируется последовательным действием двух зависящих от атф лигазов, а именно: гравитационно-глутамилцистеинового синтеза (ГКТ) и глутатионового синтеза (гс)[6].

Рис.1

После биосинтеза начинается деградация глутатиона. В этом цикле разложение осуществляется методом транспептидазы (ГГТ)-единственным ферментом, который, как известно в то время, разлагает глутатион, - который ведет транспептидическую деятельность, связанную с передачей групп грава-глутамиля аминокислотам для формирования аминокислот грава-глутамила. Деятельность GGT, требуемая в рамках цикла γ-glutamyl, представляет собой в первую очередь транспептидазу и, следовательно, фермент ' действия s в основном транспептидические, включая перенос аминокислот для образования аво-глютамильных аминокислот, которые в конечном итоге переносятся через мембраны в качестве аво-глютамильных аминокислот. Это было первоначальное понимание биосинтеза глутатиона и его метаболизма.

В более позднем исследовании Bachhawat [53] первоначально сделал вывод о Том, что граво-глутамиловый цикл не только с точки зрения функциональной роли белков транспортерных аминокислот, но и с точки зрения описания синтеза и деградации глутатиона. Это также справедливо в свете новых данных о деградации глутатиона. По мере изучения и обобщения этих новых выводов возник новый цикл, который мы называем «глутатионным циклом [7]», как показано на рис. 2.

Рис.2 цикл глутатиона

В цикле глутатиона первыми двумя шагами является биосинтез глутатиона. Биосинтез осуществляется двумя последовательными ферментами, GCL катализирует образование грава-глутамилциштейна от глутамата и циштейна в зависимости от атп реакции. Затем GS катализирует вторую зависимую от атп реакцию грава-глутамилциштейна и глицина. Затем образуется глутатион. Он может быть разлагается цитоплазматическим ChaC семейством глутатионов-специфичных разлагающих ферментов (γ-GCT) [13], образуя 5- гидроксипролайн и цистеинилглицин. Впоследствии 5- гидроксипролайн и цистейнилглицин выводятся соответственно 5- гидроксипролайн и цистейнилглициновые пептидазы для формирования глу, Cys и Gly, которые при необходимости могут быть извлечены обратно для синтеза глутатиона. Глутатион формируется посредством биосинтеза и может также образовывать GSSG, с помощью которого он балансирует и определяет среду redox [8].

4. Энзиматический синтез глутатиона

Под энзиматическим синтезом понимается использование ферментов для катализации синтеза глутатиона из трех аминокислот. В этом ферментно-катализируемом методе используются три прекурсора аминокислот в качестве субстратов, атф в качестве функционального вещества, гравитационно-глутамилцистеин-синтезаза (глутатион I) и глутатионный синтезаз (глутатион II), кофакторы (Mg2+) и надлежащая pH-среда. В настоящее время сообщается о многочисленных исследованиях по ферментативному синтезу глутатиона, однако в последние годы основное внимание уделялось синтезу двух ферментов.

Син чжан и др. [9]Синтезированный глутатион энзиматическиПутем построения многоступенчатой реакции двух ферментов (полифосфат-киназа (PPK) и глутатионный бифункциональный синтезаз (глутатион F)), с полифосфатом в качестве источника энергии, и оптимизировал экспрессионные условия комбинированных ферментов (PPK и глутатион F), в результате чего выход глутатиона составил 58± 3,3 mmol/L. Также оптимизирован фермент, синтезированный глутатионом путем ферментативного синтеза PPK и глутатиона F. Выход глутатиона достиг 58 ° / л. Ферментативное производство глутатиона характеризуется высокой скоростью преобразования и мягкими условиями. Основными факторами, сдерживающими производство фермента, являются отсутствие поставок СПС и высокие цены на него.

В этом исследовании чэнь ян и др. Векторы pET28a-glutathione f и pET28a-ppk были построены в системе, содержащей полифосфат-киназу и преобразованы в E. coli BL21, соответственно. Для возникновения реакции требуется не менее 20 ммоль атф, после чего адп генерируется и регенерируется для получения атп для непрерывного энергоснабжения реакции, а скорость преобразования субстрата может достигать 68,7% после 22 ч. Реакция осуществляется в системе, содержащей полифосфат-киназу.

5. Производство и продажа Глутатиона методом ферментации

Ферментация относится к использованию микробного метаболизма для преобразования недорогих питательных веществ в глутатион. Ферментация стала наиболее распространенным методом производства глутатиона из-за простоты выращивания микроорганизмов, наличия питательных веществ и простоты работы [11].

В настоящее время дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, baker' дрожжи s и псевдодомы syringae являются наиболее широко используемыми микроорганизмами для производства глутатиона, но большинство дрожжей имеют относительно низкое содержание глутатиона. Таким образом, выбор и разведение превосходных штаммов дрожжей, разведение диких штаммов мутацией и генной инженерией, а также оптимизация и регулирование культурных условий в процессе ферментации являются горящими темами в исследовании метода ферментации. Канг и др. [12] отдельные сушеные сахаромицевые церебрышки из нурука, содержащие 25,53 грава/мг глутатиона. Нисамедтинов и др. [13] показали более высокие уровни глутатиона в маргаритах, ферментированных отдельными штаммами дрожжей. Случайный мутагенез, вызванный уф-облучением штаммов диких Saccharomyces cerevisiae, привел к молекулярному механизму избыточной аккумуляции глутатиона. Мутанты накапливали глутатион в концентрациях, в несколько раз превышающих их материнский штамм дикого типа.

Было показано, что добавление трех прекурсоров аминокислот в дрожжевые культуры в определенной степени повышает уровень глутатиона. Пакетное добавление глутатиона в Saccharomyces cerevisiae является более ценным, чем последовательное добавление цистеина в качестве метода поощрения производства глутатиона Wen S et al.[15] исследовали двухступенчатая стратегия добавления в качестве подходящей стратегии добавления аминокислот: на первом этапе цистеин добавлялся после 2 часов инкубации, а затем после 7 часов добавлялись три аминокислоты (глютаминовая кислота, глицин и серин). В культуре шейных фляг внутриклеточный глутатион был на 55,2% выше, чем без добавления трех аминокислот.

Ван дахуи и др. [16] исследовали влияние l-цистеина и l-метионина на синтез глутатиона в культурах, соответственно, входящих в партии и в дополнение к потоку, и показали, что l-метионин повышает способность дрожжевых клеток синтезировать глутатион на стадии роста, в то время как l-цистеин значительно увеличивает содержание внутриклеточного глутатиона в дрожжевых клетках на стадии почти полного прекращения роста.

Исходя из этого, мы предложили стратегию добавления аминокислот в дрожжевые клетки на двух этапах роста, в результате чего выход глутатиона составил 1247,1 мг/л, а содержание внутриклеточного глутатиона - 24,1 мг/г. Результаты экспериментов были дополнительно улучшены. Ван шуо и др. [17] показали, что добавление глюкозы, валина и l-циштейна в культурологическую среду в процессе ферментации увеличило общий глу

Справочные материалы:

[1] чжоу сюцинь. Специальные производные аминокислоты -- глутатион [J]. Fermentation Science and Technology Newsletter, 2007, 36(2): 50-51.

[2] хуан цзинчунь, лян либинг. Способ производства сокращенного глутатиона и его применение [J]. Наука и технологии легкой промышленности, 2013, 1: 11 — 12.

[3] ван дахуэй, вэй гонюань. Перспективы применения глутатиона и текущее состояние производственных исследований [J]. Химическая и биологическая инженерия, 2004, 3: 10 — 12.

[4] чэнь цзянь, вэй гонюань, ли инь, цзоо гочэн. Производство глутатиона путем микробной ферментации [J]. Журнал вьюси университета легкой промышленности, 2004, 5: 104 — 110.

[5] орловский м., майстер а. гамма-глутамильский цикл: возможная транспортная система аминокислот. Прок натл акад ски у са. Ноябрь 1970 года; 67(3): 48-55.

[6] каур а, гаутам р, сривастава р и др. ChaC2, фермент для медленного оборота цитозолического глутатиона. J биол чем. Январь 2017; 292(2): 638-651.

[7] Bachhawat AK, Kaur A. Glutathione деградация. Антиоксидный редокс сигнал. Ноябрь 2017 года; 27(15): 1200-1216.

[8] бачхават ак, ядав с. глутатионный цикл: глутатионный метаболизм за грау-глутамиловым циклом. Июл 2018 года; 70(7): 585-592.

[9] чжан X, цуй XW, ли цл и др. Ферментативное производство глутатиона на основе системы регенерации энергетического цикла [J]. Journal of East China Science and Technology (Natural Science Edition), 2020, 46(5): 119-124.

[10] чэнь ян, у цён, тан тяньвэй. Комбинированная регенерация СПС для ферментативного синтеза глутатиона [C]. 2013 год ежегодное собрание китайского общества инженеров-химиков. 2013 год.

[11] чжао хон лин, гао ян, инь чжифэн и др. Прогресс в производстве сокращенного глутатиона путем ферментации [J]. Журнал медицинского колледжа чэнде,2013, 30(6): 516-518.

[12] Kang S H, Kim H R, Kim J H, et al. Идентификация штаммов дикого дрожжа и анализ их уровней грау-глюкан и глутатион для использования в пивоварении макгеолли. Майкобиология. Декабрь 2014; 42(4): 1-7.

[13] нисамедтинов I, кеввай к, оромец к и др. Метаболические изменения, лежащие в основе более высокого накопления глутатиона в saccharomyces cerevisiae Appl Microbiol Biotechnol. 2011 фев.; 89(4).

Февраль 2011 года; 89(4): 29-37.

[14] хара к и, кирияма к, инагаки а и др. Совершенствование производства глутатиона путем метаболической инженерии пути ассимиляции сульфата сахаромициных церебрысий. Appl Microbiol Biotechnol. 2012 Jun; 94(5): 3-9.

[15] Wen S H, Tao Z, Tan T. использование аминокислот для увеличения производства глутатиона в Saccharomyces cerevisiae. 35(6-7): 501-507.

[16] ван д, ни м, вей ги. Высокопродуктивный метод ферментации глутатиона, основанный на двухступенчатой аминокислотной добавке [J]. Наука о еде, 2017, 38(22): 22 — 27

[17] ван шуо, се юэву, чжан хуивен и др. Оптимизация ферментации, изоляции и очистки пониженного глутатиона [J]. Биотехнологический вестник, 2013(11): 180-185.

[18] ван хунги, Дэн чуня, тан хайтао и др. Влияние двух видов экзогенных стимулов на производство глутатиона путем ферментации отработанных пивных дрожжей [J]. Пищевая и ферментационная промышленность, 2014, 40(10): 54 — 57.