Исследование на глутатионе из дрожжевого экстракта

Большое количество исследований показало, что физиологическая активность глутатиона имеет большое значение для людей#39. Производство и жизнь, и оно играет важную роль в различных областях, таких, как продовольствие, лекарства и продукты здравоохранения. В настоящее время наиболее распространенным методом промышленного производства глутатиона является метод ферментации чистых штаммов, при этом используются главным образом Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli. Чистые штаммы ферментации имеют относительно жесткие требования к условиям окружающей среды, и время ферментации является относительно продолжительным. В процессе оптимизации ферментации для увеличения содержания глутатиона, увеличение урожайности глутатиона основано на условиях самих штаммов, поэтому для получения более высокой урожайности глутатиона необходимо работать над отбором штаммов с высокой урожайностью, а также повысить способность штаммов синтезировать глутатион с помощью определенных технологических средств (мутационное селекционное и перекрестное сечение генной инженерии и др.). С помощью некоторых технических средств (мутация, генная инженерия, гибридизация и т.д.) можно повысить способность штамма синтезировать глутатион. Этот метод широко используется в промышленном производстве.

Компания Компания Компания Компания B......rewer' дрожжи s очень богаты питательными веществами, и было установлено, что они содержат большое количество белков, основных аминокислот, и небольшое количество РНК, а клеточная стенка дрожжевых клеток содержит 25%-35% дрожжевых полисахаридов, в основном глюканов и маннанов [87]. В последние годы, с быстрым развитием C. C.. C.. C.. C.. C.. C.hina'. Пивоваренная промышленность, производство пива растет из года в год. По последним данным, China' производство s пива составит около 30-40 МЛН тонн с 2016 по 2021 год, а ежегодное производство пива значительно опережает другие страны, и каждые 200 т пива может производить 3,0 т brewer' дрожжевой шлам с содержанием воды около 80%.

Цель данного эксперимента — биосинтез глутатиона размера непосредственно из свежих пивных дрожжей после производства пива с точки зрения экономики и охраны окружающей среды. Преимуществом данного эксперимента является использование отходных элементов пивных дрожжей после ферментации, а также добавление большого количества биологически активных свежих дрожжей непосредственно в процесс производства глутатиона без необходимости предварительной обработки дрожжей, что не только сокращает производственный цикл и экономит энергию, но и делает пивные дрожжи дешевле и богаче. Этот метод не требует жестких условий выращивания, а синтез глутатиона может осуществляться при наличии достаточного количества сырья в условиях менее трудоемкого и дешевого производства, что может не только создать дополнительные экономические выгоды для производителей пива и обеспечить эффективное использование ресурсов, но и решить проблемы расточительства ресурсов и загрязнения окружающей среды, что имеет важные экономические и социальные последствия.

1. 1. Введение

В настоящее времяПроизводство глутатиона путем ферментации дрожжейБыла изучена внутри страны и за рубежом, и метод ферментации имеет очевидные преимущества, и штаммы, используемые для производства глутатиона в основном бактерии или дрожжевые клетки. Эти клетки легко возделываются, просты в обращении, и условия реакции мягкие. Таким образом, ферментация стала наиболее распространенным методом производства глутатиона.

Оптимизация brewer'. В процессе формирования дрожжевой культуры основное внимание уделяется питательным условиям и экологическим факторам ферментации глутатиона, включая влияние источников азота и углерода, концентраций ионов металлов и прекурсоров аминокислот на синтез глутатиона клетками.

Существует не так много докладов о прямом синтезе глутатиона Из fresh brewer' дрожжи после заправки. В этой главе влияние компонентов культуры, условий культуры и стратегий добавления прекурсоров аминокислот на синтез глутатиона brewer' дрожжи s были исследованы, чтобы узнать оптимальные условия биосинтеза и стратегии добавления аминокислот путем односторонней оптимизации экспериментов и ответной поверхностный анализ экспериментов, с тем чтобы улучшить производство глутатиона.

2. В рамках эксперимента

2.1 экспериментальные материалы

Компания Brewer' дрожжи были предоставлены пивоваренным заводом янтай мупин (свежие дрожжи пивоваренного завода после производства пива). С нового brewer' дрожжи имеют ограниченный срок службы и склонны потерять свою физиологическую активность, если оставить на долгое время, долгосрочные эксперименты должны использовать различные партии brewer's дрожжи, которые неизбежно имеют различия в физиологической активности и, следовательно, в их способности синтезировать глутатион, поэтому для того, чтобы минимизировать экспериментальные ошибки и обеспечить точность данных, мы пытались убедиться, что одна и та же партия пивных дрожжей используется под одними и теми же факторами и уровнями. Чтобы минимизировать экспериментальные ошибки и обеспечить точность данных, мы стараемся использовать одну и ту же партию brewer' дрожжи s для экспериментов под теми же факторами и уровнями.

2.2 материалы и реагенты

Таблица 2. 1 материалы и реагенты

2.3 основные инструменты и оборудование

Таблица 2.2 инструменты и оборудование

2.3 основные средства массовой информации

Материал: 25 г/л глюкозы, 10 г/л пептона, 1,0 г/л K2HPO4, 1,0 г/л KH2PO4, 0,3 г/л CaCl2, 2,5 г/л MgSO4, 0,05 г/л FeSO4.

Досредний состав, как и выше, и постсредний будет иметь некоторые корректировки в процессе оптимизации.

2.4 условия выращивания

Определенное количество предварительно обработанных brewer' дрожжевой шлам s был добавлен в коническую флягу и тщательно смешан в соответствии с отношением 20% от объема дрожжевого шлама к объему среды для растворения дрожжевого шлама. Время ферментации — 24 часа, температура ферментации — 28 градусов, скорость тряскования — 160 об/мин, объем жидкости — 24 мл /300 мл. Образцы были взяты с интервалом 3,0 ч. Биомасса клеток, общее содержание глутатиона и внутриклеточного вещества были определены в трех параллельных наборах экспериментов.

2.5. 2.. 2.. 2.. 2.. 2.. 2.. 2.. 2.. 2.. 2. методы измерения

2.5.1 Brewer'. Предварительная обработка дрожжей

Предварительная обработка свежих пивных дрожжей: в свежих пивных дрожжах навозной жижи от пивоваренного завода, добавить в два раза объем деионизированной воды и перемешать и промывать 4~5 раз, когда дрожжевой навозной жижи оседает, сбрасывать сверхъестественную и плавущую материи, многократно промывать до тех пор, пока верхний слой жидкости не станет бесцветным и прозрачным из желтого, а затем сбрасывать сверхъестественную после достаточной статики и получить дрожжевой навозной жижи в 4.0℃ холодильник для использования.

Brewer's дрожжевые клетки предварительной обработки для определения глутатиона: принять 5,0 мл брота ферментации brewer' дрожжевые элементы s и положить его в трубу центрифуги, центрифуга в 4500 об. / мин, выбросить супернатант, добавить 40% этанола раствор, экстракт для 2,0 ч при 40 гранат, центрифуга при 5000 об. / мин, и взять супернатант и разбавить его в течение определенного числа раз, которые будут использоваться в качестве образцов для определения глутатиона.

2.5.2 определение клеточной биомассы Brewer' дрожжи

Brewer' дрожжевые организмы, полученные с помощью центрифугации и трубки центрифуги, высушены в печи при 80 градусах до постоянного веса и взвешены точно, а также общий вес brewer' дрожжевые организмы s и труба центрифуги взвешивались как (w1). Затем сухой brewer' дрожжевые организмы в центрифужной трубе были вымыты, а центрифужная труба высушена до постоянного веса, вес центрифужной трубки был взвешен как (w0), а общий вес центрифужной трубки был взвешен как (w0). W (g)=w1-w0.

2.5.3 методы определения глутатиона

Метод тетроксида [64]: взять 1,0 мл испытуемого раствора для отбора проб, добавить 0,5 мл 0,1 моль/л гликолиновой кислоты, 3,5 мл 0,24 моль/л фосфатного буфера и 1,0 мл 1,0 г/л тетроксидного раствора для полной реакции в течение 20 мин, а затем значение поглощения а305 измерялось ультрафиолетовым спектрофотометром при 305 нм.

2.6 экспериментальные методы

2.6.1 определение времени ферментации пивных дрожжей

Предварительная обработка brewer' дрожжевой шлам s смешивался со средней величиной 20% по объему и добавлялся в дрожжевые фляжки 8% по объему. Ферментация непрерывно высиживалась в течение 30 часов при температуре 28 градусов и скорости вращения 160 об/мин. Общий уровень глутатиона, внутриклеточного содержания и клеточной биомассы дрожжей измерялся путем приема 5,0 мл дрожжевого брота каждые 3 часа. Были созданы три группы параллельных экспериментов.

2.6.2 основные культурные условия и влияние состава питательных веществ

2.6.2.1 влияние объема нагрузки на синтезированный глутатион

В этом эксперименте 300 мл коктейлей были заполнены 6%, 8%, 10%, 12% и 14% brewer' дрожжевой брот ферментационный и инкубационный в течение 24 часов при температуре 28 ° и скорости вращения 160 об/мин. Оптимальная нагрузка была определена путем расчета общего количества глутатиона, внутриклеточного глутатиона и биомассы brewer' дрожжевые клетки s и три группы были созданы для параллельных экспериментов.

2.6.2.2 влияние температуры на синтез глутатиона

В этом эксперименте оптимальные температуры были определены путем расчета общего глутатиона, внутриклеточного глутатиона и клеточной биомассы brewer' дрожжевые клетки с 24 - грационным, 26 - грационным, 28 - грационным, 30 - грационным и 32 - грационным, и оптимальный объем нагрузки был определен в эксперименте 2.6.2.1, и инкубация была проведена в течение 24 часов с скоростью вращения 160 об/мин. Были проведены три параллельных эксперимента.

2.6.2.3 воздействие концентрации глюкозы на синтезированный глутатион

В ходе этого эксперимента были установлены и инкубированы четыре уровня концентрации глюкозы, а именно 15 г/л, 20 г/л, 25 г/л, 30 г/л и 35 г/л, в течение 24 часов при 160 об/мин при оптимальном объеме нагрузки и температуре, определенных в ходе предыдущих экспериментов 2.6.2.1 и 2.6.2.2. Оптимальная концентрация глюкозы была определена путем расчета общего содержания глютатиона, внутриклеточного глютатиона и клеточной биомассы brewer' дрожжи. Были проведены три параллельных эксперимента.

2.6.2.4 воздействие концентрации пептона на синтезированный глутатион

В этом эксперименте использовались четыре уровня концентрации пептона: 15 г/л, 20 г/л, 25 г/л, 30 г/л и 35 г/л. Инкубация проводилась при 160 об/мин в течение 24 часов при оптимальной нагрузке, температуре и концентрации глюкозы, определенных в ходе предыдущих экспериментов. Оптимальная концентрация пептона была определена путем расчета общей глутатиона, внутриклеточного глутатиона и клеточной биомассы brewer' дрожжи. Были созданы три параллельные группы.

2.6.2.5 воздействие концентрации сульфата магния на синтезированный глутатион

В этом эксперименте были добавлены четыре уровня сульфата магния: 1,5 г/л, 2,0 г/л, 2,5 г/л, 3,0 г/л, 3,5 г/л, соответственно. При оптимальном объеме загрузки, оптимальной температуре и оптимальной концентрации глюкозы, определенных в ходе предыдущих экспериментов, инкубация в течение 24 часов производилась при 160 об/мин. Оптимальная концентрация сульфата магния была определена путем расчета общего количества глутатиона, внутриклеточного содержания глутатиона и биомассы brewer' дрожжевые клетки s. Были проведены три параллельных эксперимента.

2.6.3 методология поверхностного реагирования для оптимизации культурных условий

На основе результатов одностороннего эксперимента были отобраны три фактора: концентрация глюкозы (A), концентрация сульфата магния (B) и температура (C), после чего экспериментальная конструкция была оптимизирована с помощью boxbehnken, а факторы и уровни эксперимента показаны в таблице 2.3.

Экспериментальные факторы и уровни

Уровень 1 уровень 2 уровень 3

2.6.4 воздействие концентрации прекурсоров аминокислоты и времени добавления

В этом эксперименте мы оптимизировали стратегии добавления прекурсоров аминокислот в биосинтез-процесс brewer' дрожжевые клетки, включая концентрацию глицина (Gly), глутамической кислоты (Glu) и цистеина (Cys), и время добавления трех прекурсоров аминокислот, и, наконец, мы определили оптимальную концентрацию и время добавления на общее количество синтезированного глутатиона. Первоначальные концентрации трех прекурсоров аминокислот составили 10 ммоль/л для Gly, 6 ммоль/л для Glu и 4 ммоль/л для Cys, а для brewer& - 21 час#39; дрожжевые клетки s, и 24 ч для brewer' дрожжевые клетки s.

2.6.4.1 влияние концентрации Gly на синтез глутатиона

Три прекурсора аминокислот были добавлены вместе, и первоначальные концентрации Glu и Cys оставались неизменными на уровне 6 ммоль/л и 10 ммоль/л, соответственно, в то время как концентрация Gly была изменена на 3,0 ммоль/л, 6,0 ммоль/л, 9,0 ммоль/л, 12 ммоль/л и 15 ммоль/л. Оптимальная концентрация глу была определена путем расчета общего содержания глютатиона, внутриклеточного содержания глютатиона и индексов клеточной биомассы. Общее содержание глутатиона, внутриклеточного глутатиона и клеточной биомассы brewer' дрожжи s были рассчитаны для определения оптимальной концентрации глу и изучения его воздействия на синтез глутатиона. Были проведены три параллельных эксперимента.

2.6.4.2 влияние концентрации глу на синтез глутатиона

Оптимальная концентрация глу была установлена на уровне 3,0 ммоль/л, 6,0 ммоль/л, 9,0 ммоль/л, 12 ммоль/л и 15 ммоль/л, а оптимальная концентрация глу была определена путем расчета общего количества глутатиона, внутриклеточного содержания глутатиона и индексов биомассы brewer' дрожжевые клетки s. Общее количество глутатиона, внутриклеточного содержания глутатиона и клеточной биомассы brewer' дрожжи s были рассчитаны для определения оптимальной концентрации глу и изучения воздействия глу на синтез глутатиона. Были созданы три группы параллельных экспериментов.

2.6.4.3 влияние концентрации Cys на синтез глутатиона

Оптимальные концентрации Gly и Glu в вышеупомянутых экспериментах остались неизменными, а концентрации Cys были изменены на 2,0 ммоль/л, 4,0 ммоль/л, 6,0 ммоль/л и 8,0 ммоль/л. Общее содержание глутатиона и внутриклеточного глутатиона, а также показатели биомассы brewer' дрожжевые клетки s были рассчитаны для определения оптимальной концентрации Cys с целью изучения ее воздействия на синтез глутатиона. Оптимальная концентрация Cys была определена путем расчета общего количества глутатиона, внутриклеточного содержания глутатиона и индексов биомассы brewer' дрожжевые клетки s для изучения воздействия Cys на синтез глутатиона. Были созданы три параллельные экспериментальные группы.

2.6.5 методология поверхностного реагирования для оптимизации концентраций прекурсоров аминокислот

На основе результатов односторонних экспериментов были отобраны три фактора, а именно: концентрация глицина (а), концентрация глутамической кислоты (в) и концентрация цистеина (с), после чего была оптимизирована структура экспериментов с помощью метода "Box-Behnken", а факторы и уровни экспериментов показаны в таблице 2.4.

Таблица 2.4 экспериментальные факторы и уровни

Примечание: концентрации глицина, глутамической кислоты и цистеина указаны в ммо/л.

2.6.6 влияние сроков добавления аминокислоты-прекурсора на синтез глутатиона

После определения оптимальных концентраций трех прекурсоров аминокислот влияние дополнительного времени прекурсоров аминокислот на синтез глютатиона brewer' дрожжи были исследованы, и было установлено, что добавочное время составляет 13 ч, 16 ч, 19 ч, 21 ч и 24 ч, соответственно. The brewer' дрожжевые клетки s выращивались в течение 24 часов. Оптимальное время добавления прекурсоров аминокислот было определено путем расчета общего количества глутатиона, внутриклеточного содержания глутатиона и биомассы brewer' дрожжевые клетки s. Были проведены три параллельных эксперимента.

2.6.7 определение срока годности Brewer' дрожжи

В этом эксперименте мы измерили изменения в росте клеток и общее количество глутатиона, произведенного brewer's дрожжи в течение периода 25 d. результаты были получены с первого дня свежий brewer' собрание дрожжей до 25 - го дня. Клеточная биомасса, общее содержание глутатиона и внутриклеточного глутатиона в brewer' дрожжи s измерялись каждый день с первого дня сбора до 25 - го дня инкубации свежего brewer' дрожжи хранятся в холодильнике в 4℃ до инкубации, и после инкубации brewer' дрожжи оптимизированы для 24 ч с добавлением прекурсоров аминокислот, и постепенное увеличение клеточной биомассы, общего содержания глутатиона и внутриклеточного глутатиона brewer' дрожжи s до и после инкубации были рассчитаны. Постепенное изменение общего содержания глутатиона и внутриклеточного глутатиона было рассчитано до и после инкубации дрожжей.

2.7 результаты и анализ

2.7.1 определение времени ферментации пивных дрожжевых элементов

По результатам суммарного глутатиона, внутриклеточного содержания глутатиона и биомассы дрожжевых элементов, которые были измерены и рассчитаны через 30 ч brewer' дрожжевой культуры, результаты были показаны на рис. 2.1, из которого видно, что brewer' дрожжевые клетки s синтезировали внутриклеточный глутатион в период от 0 ч до 13 ч., так как клетки продолжали расти, и что brewer' дрожжевые клетки s в основном прекратили расти и по-прежнему синтезировали глутатион от 13 до 26 ч. Общее содержание глутатиона было измерена и рассчитано после 30 ч культуры, а общее содержание глутатиона и биомассы дрожжевых клеток были показаны на рис. 2.1. От 13 до 26 часов, рост brewer' дрожжевые клетки s в основном остановились, пока глутатион еще был синтезирован. Исследования показали [62], что добавление аминокислот-прекурсоров на этих двух этапах может увеличить производство глутатиона. Общее содержание глутатиона, внутриклеточного глутатиона и биомассы дрожжевых элементов составило 102,42 мг/л, 4,66 мг/г и 21,46 г/л в свежих дрожжевых клетках пивоваренного завода сразу после производства пива. Экспериментальные данные свидетельствуют о Том, что если глутатион добывается непосредственно, то урожайность глутатиона низкая, а экономическая выгода низкая, поэтому считается, что свежие дрожжи непосредственно из резервуара используются для целевой рекультивации, при полном использовании глутатиона, синтезирующего ферментную систему в свежих дрожжевых клетках, обеспечивая соответствующее питание и культурные условия для дальнейшей биосинтеза глутатиона. Как показано на рис. 2.1, общая масса глутатиона, внутриклеточного глутатиона и дрожжевой биомассы достигла максимальных значений 26,82 г/л, 7,79 мг/г и 208 мг/л, соответственно, после 24 часов инкубации. Учитывая фактор времени, было определено оптимальное время ферментации 24 часа, что сэкономило много времени и ресурсов по сравнению с чистой ферментацией.

Рис. 2. 1 год назад#39; кривые роста дрожжей и синтеза глутатиона.

2.7.2 влияние основных культурных условий и питательных веществ

2.7.2.1 влияние объема нагрузки на синтез глутатиона

Количество жидкости, загруженной в эксперимент, в основном считается уровнем растворенного кислорода в brewer' дрожжевые культуры среды, которая влияет на рост brewer' дрожжевые клетки s, а также синтез внутриклеточных глутатионов в определенной степени.

Рис. 2.2 влияние объема нагрузки на синтез глутатиона

Рис.2.2 влияние жидкой нагрузки на синтез глутатиона

На рис. 2.2 показано, что общее количество глутатиона, внутриклеточных глутатионов и биомассы дрожжевых элементов увеличивалось, а затем уменьшалось по мере увеличения объема загрузки. Основной причиной этого может быть то, что, когда объем загрузки был небольшим, запас кислорода был достаточным и рост brewer' дрожжи s были сильными, и увеличение биомассы brewer' дрожжевые клетки s привели к увеличению общего количества глутатиона, и биомассы brewer' дрожжевые элементы s достигли максимального значения 27,12 г/л при объеме загрузки 8%, а биомасса brewer' дрожжевые клетки s были постепенно уменьшены с увеличением объема загрузки, поэтому рост brewer' дрожжевые клетки s будут подавлены при большем объеме загрузки и росте brewer' дрожжевые элементы s будут ингибироваться при большем объеме нагрузки. Общий глутатион и внутриклеточный глутатион достигли максимального значения 212,07 мг/л и 7,82 мг/г, соответственно, на уровне 8%.

2.7.2.2 влияние температуры на синтез глутатиона

Температура является одним из важнейших факторов, влияющих на рост дрожжевых клеток. Температура влияет на активность синтеза глутатиона, что, в свою очередь, влияет на способность brewer' дрожжи для синтеза глутатиона, что приводит к различиям в производстве глутатиона. Влияние температуры на ферментную активность заключается в Том, что, как правило, слишком низкая или слишком высокая температура приводит к снижению ферментной активности, и только при оптимальной температуре ферментная активность становится максимальной.

Как показано на рис. 2.3, биомасса дрожжевых элементов и способность синтезировать глутатион увеличивались по мере повышения температуры, а максимальные значения общей глутатиона, внутриклеточного глутатиона и дрожжевой клеточной биомассы достигались на уровне 28 граваций, которые составляли 216,51 мг/л, 7,85 мг/г и 27,62 г/л, соответственно.

Рис. 2.3 влияние температуры на синтез глутатиона

2.7.2.3 влияние концентрации глюкозы на синтез глутатиона

Глюкоза необходима для роста и воспроизводства дрожжевых клеток и биосинтеза глутатиона. Глюкоза может обеспечить дрожжевые клетки энергией, необходимой им для роста, и, с другой стороны, она также обеспечивает атф для синтеза глутатиона, что в свою очередь способствует синтезу глутатиона. Правильная концентрация глюкозы не только способствует росту brewer' дрожжевые клетки s, но и синтез глутатиона Рядом с дрожжевыми клетками.

Рис. 2.4 влияние концентрации глюкозы на синтез глутатиона

Рис.2.4 влияние концентрации глюкозы на синтез глутатиона

Как показано на рис. 2.4, биосинтез глутатиона увеличился с увеличением концентрации глюкозы, а общее содержание глутатиона, внутриклеточного глутатиона и биомассы дрожжевых элементов достигло максимальных значений при 25 г/л глюкозы, которые составили 211,52 мг/л, 7,82 мг/г и 27,82 г/л, соответственно. Общее количество глутатиона, внутриклеточной глутатиона и дрожжевой биомассы достигло максимальных значений соответственно 211,52 мг/л, 7,82 мг/г и 27,82 г/л.

2.7.2.4 влияние концентрации пептона на синтез глутатиона

Источник азота является одним из важных условий роста дрожжевых элементов, и различные органические источники азота оказывают определенное влияние на рост и синтез внутриклеточных веществ в дрожжах. В ходе эксперимента в основном изучалось влияние различных концентраций пептона на синтез глутатиона компанией brewer' дрожжи. Как видно из рис. 2.5, влияние концентрации пептона на общее количество глутатиона не является значительным, а также влияние на биомассу brewer' дрожжевые клетки s также не имеет значения. В целом влияние концентрации пептона на производство глутатиона не является очевидным, и с точки зрения экономии затрат можно считать, что на более позднем этапе исследования не следует добавлять пептон в сферу культуры.

Рис. 2.5 влияние концентрации пептона на синтез глутатиона

2.7.2.5 влияние концентрации сульфата магния на синтез глутатиона

Магний ион необходим для синтеза глутатиона, который может повысить активность синтезаза глутамин-цистеин (глутатион 1) и синтезаза глутатион - 2 (глутатион 2), уменьшить ингибирование обратной связи глутатиона - 1 и улучшить фермент-активность [54]. Поэтому добавление соответствующего сульфата магния в инкубационный процесс благотворно влияет на синтез глутатиона и улучшает общее производство глутатиона.

На рис. 2.6 можно сделать вывод, что концентрация MgSO4 оказывает относительно большое влияние на синтез глутатиона brewer' дрожжи, а также оказывает большое влияние на рост brewer' дрожжевые клетки s. С увеличением концентрации MgSO4 общее количество глутатиона и клеточной биомассы увеличилось, а также общее количество и внутриклеточную массу brewer' дрожжевые элементы s достигли максимального значения, когда концентрация MgSO4 составляла 2,5 г/л, т.е. 212,88 мг/л, 7,81 мг/г, 27,25 г/л, поэтому оптимальная концентрация MgSO4 может быть определена как 2,5 г/л. 212,88 мг/л, 7,81 мг/г и 27,25 г/л, таким образом, оптимальная концентрация MgSO4 может быть определена как 2,5 г/л. Концентрация MgSO4 составила 2,5 г/л.

Рис. 2.6 влияние концентрации MgSO4 на синтез глутатиона

2.7.3 эксперименты по проектированию ответной поверхности для оптимизации условий культуры

На основе результатов вышеуказанных односторонних экспериментов по оптимизации культурных условий для биосинтеза глутатиона в brewer' дрожжи, результаты

Был проведен эксперимент по проектированию ответной поверхности (осб) с использованием эксперта по проектированию 10,0 для изучения воздействия концентрации глюкозы (а), сульфата магния (в) и температуры (с) на общее количество глутатиона (у), который был проанализирован методом анализа ответной поверхности (аср).

2.7.3.1 регрессионный анализ на основе метода шаблона behnken

Таблица 2.5 boxbehnken дизайн и результаты

Трехфакторный, трехуровневый эксперимент по проектированию поверхности ответа на синтез глутатиона в brewer' дрожжи s были выполнены с использованием программного обеспечения Design Expert 10.0, и результаты были проанализированы регрессионным анализом. Квадратическое уравнение многонациональной регрессии коэффициентов селективности общего биосинтеза глутатиона, калиброванного компанией brewer' дрожжи s в отношении концентраций глюкозы (A), сульфата магния (B) и температуры (C) были получены следующим образом: Y= 194,56 + 5,04 *A- 5,61 *B- 7,53 *C+ 0,14 *AB. B. B - 0,20 *Класс c + 5,07 *До н.э. + 7,99 *A- 2 5,04 *A-12.61*B-7.53*C+0. 14*AB-0.20*Класс c+5.07*До н.э.+7.99*1 2 3 4-

37. 13*Класс Класс B2-46.98*C - 2 2.7.3.2 анализ дисперсии (анова)

Анализ дисперсии для уравнений регрессии

Примечание: R2= 0,9969; R2Adj= 0,9930; "*" (*) Означает значительную разницу (P < 0,05); "**". Означает весьма значительную разницу (P < 0,01).

Как видно из таблицы 2.6, значение F модели составляет 252,64, а значение P - < 0,0001, что указывает на то, что разница между регрессионной моделью является весьма значительной, R2= 0,9969, что указывает на то, что 99,69% вариации можно объяснить с помощью модели R2Adj= 0,9930, что указывает на то, что модель R2Adj является значительной, а значения R2Adj относительно близки друг к другу, что указывает на то, что регрессионная модель является более разумной и уравнение хорошо подходит. Значения R2 и R2adj близки друг к другу, что означает, что регрессионная модель разумна, расположение уравнения велико, экспериментальная погрешность мала, и модель может быть использована для анализа и прогнозирования культурных условий синтеза глутатиона в brewer' дрожжи. Значение p неверного термина составило 0,9820 > 0,01, что указывает на то, что разница между неверным термином не является значительной, т.е. модель не имеет явления несоответствия, и модель может хорошо описать эксперимент, и модель используется для анализа воздействия глюкозы, сульфата магния и температуры на производство глутатиона, с тем чтобы получить оптимальный уровень реакции молекул.

В модели, за исключением AB, AC и BC, все позиции значительны, из которых A значимы, B, C, A2, B2 и C2 очень значимы, что указывает на то, что глюкоза оказывает большое влияние на производство глутатиона, сульфат магния и температура оказывают большое влияние на производство глутатиона, и соотношение между влиянием этих трех факторов является B (сульфат магния) > C (температура) > A (глюкоза).

2.7.3.3 анализ поверхности срабатывания

Комбинируя результаты первого и второго порядка уравнения модели, можно сделать вывод, что влияние глюкозы (A), сульфата магния (B) и температуры (C) на синтез глутатиона Brewer' дрожжи s сложны и не являются простыми линейными отношениями, и эффект реакции поверхности является значительным. Схема поверхности реакции показана на рис. 2.7.

Рисунок 2.7 поверхностный график взаимодействия факторов на синтезе глутатиона brewer' дрожжи

(a) сульфат магния-глюкоза (b) глюкоза-температура (c) температура-сульфат магния

Рис.2.7 поверхностная диаграмма реакции различных факторов на синтез глутатиона пивными дрожжами

На рис. 2.7 видно, что результаты вышеупомянутых односторонних экспериментов согласуются с результатами эксперимента по проектированию ответной поверхности (пб), в ходе которого общее количество глутатиона увеличивается, а затем уменьшается по мере увеличения уровней влияющих факторов. Эксперимент по проектированию ответной поверхности может четко отражать важное влияние взаимодействия различных факторов на результаты эксперимента. Наклон поверхности реакции представляет силу воздействия фактора на общее количество глутатиона.

Чем ближе контурные линии на уровне поверхности реакции к эллипсу, тем значительнее влияние взаимодействия двух факторов на результаты эксперимента. Когда контурные линии поверхности реакции ближе к окружностям, взаимодействие двух факторов оказывает менее существенное влияние на результаты экспериментов. На рисунке видно, что взаимодействие между факторами было значительным, за исключением взаимодействия между температурой и сульфатом магния, которое не было значительным на общее количество глутатиона.

Анализируя регрессионную модель, brewer& определяет оптимальные условия для синтеза глутатиона#39; дрожжи s имели концентрацию глюкозы 24,66 г/л, сульфата магния 2,41 г/л и температуру 28,10 грава, а общее количество глутатиона в этих условиях составило 195,64 мг/л. В ходе проверочного эксперимента вышеуказанные условия были повторены, и фактическое общее количество глутатиона составило 198,62 мг/л. Разница между общим количеством глютатиона, полученным в результате неоднократных экспериментов, и прогнозируемым значением была небольшой, что указывает на то, что эта модель может предсказывать культурные условия brewer' дрожжи для синтеза глутатиона лучше, и общее количество глутатиона, полученное в результате анализа поверхности реакции, было немного ниже, чем полученное в ходе эксперимента по односторонней оптимизации, который был главным образом обусловлен тем, что эксперимент по анализу поверхности реакции и эксперимент по односторонней оптимизации были разными. Общее количество глутатиона, полученное после анализа поверхности реакции, было немного меньше, чем при односторонней оптимизации, главным образом потому, что эксперимент по анализу поверхности реакции и эксперимент по односторонней оптимизации проводились с различными партиями brewer' дрожжи s, так что результаты были несколько различными, как упоминалось в 2.2.1 экспериментальных материалов.

2.7.4 воздействие концентрации прекурсоров аминокислоты и времени добавления

Синтез глутатиона в brewer' дрожжевые клетки s требуют двухэтапной реакции, в которой прекурсоры аминокислоты участвуют в синтезе глутатиона в качестве промежуточных веществ в реакции, поэтому для системы реакции концентрация реагентов оказывает определенное влияние на синтез продуктов, а добавление требуемых веществ в нужное время окажет определенное воздействие на синтез продуктов, Поэтому мы должны добавить прекурсор аминокислоты и оптимизировать концентрацию и время добавления в оптимальное время биосинтеза стадии brewer' дрожжи. Поэтому необходимо добавить прекурсоры аминокислот в оптимальное время на этапе биосинтеза brewer' дрожжи, и оптимизировать концентрацию прекурсоров аминокислот и время добавления.

2.7.4.1 воздействие концентрации Gly на синтезированный глутатион

Gly, как реагент на втором этапе синтеза глутатиона, является Синтезирован из промежуточного станка γ-glutamylcysteine, вместе с атф и Gly, и катализирован glutathione 2. Таким образом, концентрация Gly оказывает определенное влияние на синтез глутатиона.

Рис. 2.8 влияние концентрации глу на синтезированный глутатион

На рис. 2.8 показано, что общее содержание глютатиона и внутриклеточного глютатиона, а также клеточной биомассы увеличивалось по мере увеличения концентрации глютатиона, что свидетельствует о Том, что увеличение концентрации глютатиона не только способствует росту brewer' дрожжевые клетки s, но также облегчает синтез глутатиона brewer' дрожжи. Когда концентрация Gly составляла 12 ммоль/л, общее содержание глютатиона и внутриклеточной массы достигло максимального значения, и с увеличением концентрации общее содержание глютатиона и внутриклеточной массы начало снижаться, и в это время общее содержание глютатиона составило 302,54 мг/л, внутриклеточной биомассы - 8,98 мг/г. Таким образом, оптимальная концентрация Gly составляла 12 ммоль/л на момент максимального значения общего глутатиона. Таким образом, оптимальная концентрация Gly составляла 12 ммоль/л при максимальном значении общего глутатиона.

2.7.4.2 влияние концентрации глу на глутатион

Глу является основным реагентом для синтеза глутатиона, а глутатионе1 катализирует синтез грау-глутамилциштейна под энергоснабжением атф, поэтому концентрация глу оказывает определенное влияние на синтез глутатиона. На рис. 2.9 показано, что общее количество глутатиона постепенно увеличивалось по мере увеличения концентрации глу, а общее количество глутатиона, внутриклеточного содержания и клеточной биомассы достигло максимального значения, когда концентрация глу составляла 6,0 ммоль/л, что составляло 309,85 мг/л, 9,12 мг/г и 33,86 г/л, соответственно, а по мере увеличения концентрации глу общее количество и внутриклеточную массу начали уменьшаться, однако воздействие на клеточную биомассу начало уменьшаться. По мере дальнейшего увеличения концентрации глу общее количество глутатиона и внутриклеточное содержание глутатиона начали сокращаться, однако общее воздействие на клеточную биомассу было незначительным. Поэтому оптимальная концентрация глу для синтеза глутатиона была определена на уровне 6,0 ммоль/л. Концентрация глу на стадии синтеза глутатиона была определена в 6,0 ммоль/л.

Рис. 2.9 влияние концентрации глу на глутатион

2.7.4.3 влияние концентрации Cys на глутатион

Как Cys, так и Glu являются первоначальными субstrates для синтеза глутатиона, а синтез промежуточного глутатиона (γ-glutamylcysteine) стимулируется атф и глутатионом 1, поэтому концентрация Cys влияет на синтез глутатиона.

Рис. 2. 10 эффект концентрации Cys на глутатионе

Как показано на рис. 2.10, по мере увеличения концентрации Cys общее количество глютатиона и клеточной биомассы сначала увеличивалось, а затем постепенно сокращалось, поэтому можно видеть, что Cys оказывает ингибиторное воздействие на рост brewer' дрожжи, и чем выше концентрация Cys, тем очевиднее тормоз роста brewer' дрожжевые клетки s. Когда концентрация Cys составляла 4,0 ммоль/л, общее содержание глутатиона и внутриклеточного вещества достигло максимального значения, а максимальное значение общего содержания глутатиона составило 310,42 мг/л, что на 51,33% выше, чем у контрольной группы.

2.7.5 методология поверхностного реагирования для оптимизации концентраций прекурсоров аминокислот

На основе результатов вышеупомянутых односторонних экспериментов по синтезу глутатиона в brewer' дрожжи s оптимизируют концентрацию прекурсоров аминокислот.

Поверхностные эксперименты по изучению реакции проводились с использованием эксперта по проектированию 10,0 для изучения воздействия концентрации глицина (A), концентрации глутамата (B) и концентрации цистеина (C) на общее количество глутатиона (Y), и был проведен анализ поверхности реакции, результаты которого показаны в таблице 2.7, а анализ дисперсии (ANOVA)-в таблице 2.8.

2.7.5.1 регрессионный анализ на основе метода шаблона behnken

Таблица 2.7 дизайн и результаты boxbehnken

С использованием программного обеспечения Design Expert 10.0 на условиях синтеза глутатиона в brewer& был проведен 3- факторный, 3- уровневый дизайн поверхности реакции экспериментов#39; дрожжи, и результаты были проанализированы регрессионным анализом, чтобы получить общее количество глутатиона биоинтезирования brewer' дрожжи.

Квадратическое уравнение многонациональной регрессии для коэффициентов селективности концентрации глицина (A), концентрации глутамата (B) и цистеина (C): Y= 313,77 + 10,08 *A+ 2,62 *B- 14,92 *C+0. 17*AB+ 0,018 *AC-0. 15* бк - 23,88 * а2-13,29 * в2-53,22 * с2

2.7.5.2 анализ дисперсии (анова)

Как видно из таблицы 2.8, значение F модели составляло 275,81, а значение P - < 0,0001, что указывает на весьма значительную разницу между регрессионной моделью. R2= 0,9972 указал, что 99,72% отклонений может быть объяснено с помощью модели, а R2Adj= 0,9960 указал, что значение модели является хорошим, а значения R2 и R2Adj относительно близки друг к другу, что указывает на то, что регрессионная модель является более разумной и уравнение подходит хорошо. Значения R2 и R2adj близки друг к другу, что свидетельствует о разумности регрессионной модели, высокой степени соответствия уравнению и малой экспериментальной погрешности.

Анализ дисперсии для уравнений регрессии

Примечание: R2= 0,9972; R2Adj= 0,9936; "*" (*) Означает значительную разницу (P < 0,05); "**". Означает весьма значительную разницу (P < 0,01).

Значение p неподходящего термина составляло 0,1092 > 0,01, что указывает на то, что разница между неподходящим термином не является значительной, т.е. в модели не было неподходящего явления, и модель была в состоянии хорошо описать эксперименты. Модель была использована для анализа влияния глутамата, глутамата и цистеина на производство глутатиона и определения оптимального уровня молекул реакции. В модели значительны все позиции, за исключением AB, AC и BC, из которых значительны B, а также A, C, A2, B2 и C2, что указывает на то, что концентрация глутамата оказывает сильное воздействие на урожайность глутатиона, а концентрации глицина и цистеина оказывают сильное воздействие на урожайность глутатиона, и соотношение между этими тремя факторами составляет C (цистеин) > A (глицин) > B (глутамат). C (цистеин) > A (глицеин) > B (глутамическая кислота).

2.7.5.3анализ поверхности реакции

Комбинируя результаты первого и второго порядка уравнений моделей, можно увидеть, что влияние концентрации глицина (а), глютамической кислоты (в) и концентрации цистеина (с) на синтез глютатиона Brewer' дрожжи s являются сложными, а не простыми линейными отношениями, и эффект реакции поверхности является значительным. Схемы реагирования показаны на рис. 2.11.

Рис. 2. 11 поверхностные участки реакции аминокислот-прекурсоров на синтез глутатиона brewer' дрожжи по взаимодействию факторов

(a) глютамат-глютамат (b) глюцин-цистейн (c) цистейн-глютамат

Рис.2. 11 поверхностная диаграмма реакции взаимодействия прекурсоров аминокислот с пивными дрожжами для синтеза глутатиона

На рис. 2.11 видно, что результаты вышеупомянутых односторонних экспериментов согласуются с результатами эксперимента по проектированию ответной поверхности (осб), в ходе которого общее количество глутатиона увеличивается, а затем уменьшается по мере увеличения уровней влияющих факторов. Эксперимент по проектированию ответной поверхности может четко отражать важное влияние взаимодействия различных факторов на результаты эксперимента. Наклон поверхности реакции показывает силу воздействия каждого фактора на общее количество глутатиона. Чем ближе контур горизонтальной плоскости поверхности реакции к эллипсу, тем значительнее влияние взаимодействия двух факторов на экспериментальные результаты.

Чем ближе контур горизонтальной плоскости поверхности реакции к окружности, тем менее значительным является влияние взаимодействия двух факторов на экспериментальные результаты. Как видно из диаграммы, взаимодействие между этими факторами было значительным, за исключением взаимодействия между глицином и цистеином, которое не было значительным для общего глутатиона.

Анализируя регрессионную модель, оптимальные условия для синтеза глутатиона в brewer' дрожжи s составляли 12,64 ммоль/л для глицина, 6,30 ммоль/л для глутамата и 3,72 ммоль/л для цистеина, и в этих условиях общее количество глутатиона составляло 316,01 мг/л. В ходе проверочного эксперимента вышеуказанные условия были повторены, и фактическое количество глутатиона составило 315,65 мг/л. Общее количество глутатиона, полученное в результате неоднократных экспериментов, не сильно отличалось от прогнозируемого значения, что свидетельствовало о Том, что эта модель вполне может предсказывать культурные условия для синтеза глутатиона в brewer' дрожжи.

2.7.6 влияние времени добавления аминокислоты-прекурсора на глутатион

Brewer' рост дрожжевых элементов s разделен на две фазы: первая фаза — это рост самого дрожжевого элемента, в котором сам дрожжевой элемент растет и увеличивается в количестве, с небольшим количеством синтеза дрожжевых глутатионов; Второй этап — синтез внутриклеточного глутатиона, из-за истощения глюкозы и других питательных веществ в культуре, сама клетка достигает пика по количеству, а затем синтез клеточного содержания, включая большое количество глутатиона синтеза, лианг бин и др. Второй этап представляет собой внутриклеточный этап синтеза глутатиона, на котором количество клеток достигает пика из-за истощения глюкозы и других питательных веществ в компонентах культуры, за которым следует синтез клеточного содержания, включая большое количество синтеза глутатиона. После 30 часов инкубации внутриклеточная концентрация составила 10,41 г/л, что на 10,5% выше контрольной концентрации, а производство глутатиона составило 278 мг/л, что на 116% выше контрольной концентрации.

Соответствующие исследования показали, что добавление прекурсоров аминокислот на стадии синтеза глутатиона приведет к дальнейшему увеличению общего количества глутатиона, следовательно, согласно синтезу глутатиона в brewer' дрожжевые клетки в этом эксперименте, мы установили время добавления прекурсоров аминокислот в brewer' дрожжевые клетки на 13, 16, 19 и 24 ч клеточной культуры.

Рис. 2. 12 влияние времени добавления смешанных прекурсоров аминокислот на глутатион

Рис.2. 12 влияние времени добавления аминокислот-прекурсоров на глутатион

Как показано на рис. 2.12, с увеличением времени добавления, содержание глутатиона и внутриклеточного содержания достигло максимального значения 21 ч., а клеточная биомасса также достигла максимального значения, однако в общем уровне разницы не было, а общее содержание глутатиона, внутриклеточного глутатиона и биомасса дрожжевых элементов значительно сократилась на 24 ч. Который был близок к максимальному производству глутатиона в дрожжевых клетках в оптимизированных условиях выращивания, но без добавления прекурсоров аминокислот. Общее количество глутатиона, внутриклеточное содержание глутатиона и биомасса дрожжевых элементов значительно сократились при 24 ч., что было близко к максимальному производству глутатиона в дрожжевых клетках в оптимизированных культурных условиях без добавления прекурсоров аминокислот. Причиной этого может быть то, что добавление прекурсоров аминокислот в 24 ч был конец ферментации brewer' дрожжевые клетки s и дрожжевые элементы Клетки не смогли синтезировать свой собственный глутатион из аминокислот-прекурсоров за короткий период времени. Когда время добавления составляло 21 час, максимальное содержание глутатиона составляло 315,87 мг/л, что на 52,51% больше, чем у контрольной группы, поэтому оптимальное время добавления было определено в 21 час. Результаты показали, что производство глутатиона дрожжей было выше, чем у контрольной группы.

2.7.7 определение времени удержания элементов Brewer' дрожжи

Во время экспериментального исследования brewer' дрожжи, было установлено, что способность дрожжевых клеток синтезировать глутатион в тех же условиях снизилась с увеличением времени хранения после свежего brewer' дрожжи s были извлечены, и способность дрожжей синтезировать глутатион ослабла с увеличением времени хранения. Таким образом, для обеспечения стабильности экспериментальных данных, время хранения brewer' дрожжевые клетки s были измерены для обеспечения того, чтобы эксперименты были проведены как можно скорее до снижения способности brewer' дрожжевые клетки s синтезировать глутатион, чтобы точно понять точность результатов экспериментов.

Рис. 2. 13 изменения в биомассе клеток и увеличение производства глутатиона в brewer' дрожжи до и после оптимизации более 25 d.

На рис. 2.13 видно, что с увеличением времени хранения повышается скорость увеличения биомассы оптимизированного культурного brewer' дрожжевые клетки s постепенно уменьшается, что указывает на рост brewer' дрожжевые элементы с большим временем хранения значительно не увеличились после оптимизации, и это может быть главным образом из-за того, что деятельность brewer' дрожжевые клетки s были сильно потеряны, и увеличение общего количества глутатиона было небольшим, что не способствовало последующей экспериментальной операции изоляции.

Физиологическая активность brewer' дрожжи s уменьшились с увеличением времени хранения, а его рост и глутатион производственные мощности уменьшились с увеличением времени хранения при низкой температуре. Общее количество глутатиона, внутриклеточного содержания глутатиона и скорость увеличения биомассы дрожжевых элементов уменьшились на 5%, 7% и 9%, соответственно, когда время хранения превышало 5 d. поэтому лучше всего выращивать дрожжи в течение первых 5 d после того, как свежих дрожжей сбросили из резервуаров, чтобы увеличить выход биологически синтезированного глутатиона в brewer' дрожжи. Поэтому лучше всего вырабатывать дрожжи для производства глутатиона в течение первых 5 дней после приема свежего brewer' дрожжи из бака, чтобы увеличить выход глутатиона биосинтеза brewer' дрожжи.

3. Ii. Резюме

В этом эксперименте мы использовали brewer' дрожжевые клетки s в качестве штаммов, и исследовал условия культуры и прекурсоров аминокислотной добавки стратегии для повышения способности brewer' дрожжи для синтеза глутатиона сами по себе. Были сделаны следующие выводы:

(1) в результате односторонней оптимизации культурных условий было окончательно определено, что основными компонентами культурной среды являются глюкоза и MgSO4, концентрации 22 г/л ~28 г/л и 2,0 г/л ~ 3,0 г/л, соответственно, и внешние условия 26℃~28℃, с жидким объемом 8%. На основе метода проектирования ответной поверхности были дополнительно оптимизированы три основных фактора концентрации глюкозы, концентрации и температуры сульфата магния для обеспечения оптимальных условий технологического процесса: концентрация глюкозы 24,66 г/л, концентрация сульфата магния 2,41 г/л и температура 28,10 ° с. В этих условиях общее количество глутатиона составило 198,62 мг/л, что на 93,93% выше первоначального количества глутатиона. Оптимальное время инкубации brewer' дрожжевые клетки s были 24 ч, который был определен путем измерения изменений роста brewer' дрожжи.

(2) в результате однокомпонентной оптимизации глицина, глютамической кислоты и цистейна было окончательно определено, что три прекурсора аминокислот будут добавлены при концентрации 9,0 ммоль/л до 15 ммоль/л для глу, 3,0 ммоль/л до 9,0 ммоль/л для глу и 2,0 ммоль/л до 6,0 ммоль/л для глу, и на основе этого были получены оптимальные технологические условия путем использования метода проектирования поверхности реакции для дальнейшей оптимизации трех основных факторов концентрации глу, концентрации глу и концентрации ГМС. На этой основе три основных фактора концентрации глу, концентрации глу и концентрации Cys были дополнительно оптимизированы с использованием конструкции поверхности реакции для получения оптимальных технологических условий: концентрация глицеина 12,64 ммоль/л, концентрация глутамической кислоты 6,30 ммоль/л, концентрация цистеина 3,72 ммоль/л и общее количество глютатиона, полученное в этих условиях, составило 315,65 мг/л. По сравнению с оптимальными технологическими условиями общее количество глутатиона, полученного при оптимальных технологических условиях, составило 315,65 мг/л. Общее количество глутатиона увеличилось на 58,92% по сравнению с оптимальными условиями и на 208,19% по сравнению с исходным количеством глутатиона. Оптимизировав время добавления прекурсоров аминокислот, было установлено, что это время добавляется через 21 час после инкубации brewer' дрожжи.

(3) наконец, время сохранения brewer' дрожжевые клетки s были исследованы. По прошествии 25 дней исследование показало, что производство глутатиона, внутриклеточное содержание и клеточная биомасса brewer' дрожжи s уменьшились с увеличением времени консервации, и процент увеличения производства глутатиона, внутриклеточного содержания и клеточной биомассы brewer' дрожжи s уменьшается с добавлением прекурсоров аминокислот, так что эксперимент должен быть проведен в течение 5 дней после свежего brewer' дрожжи s были извлечены из цистерны для увеличения ее производства. Таким образом, эксперимент должен быть проведен в течение 5 d после свежего brewer' дрожжи s были извлечены из резервуара с целью повышения урожайности и обеспечения стабильности экспериментальных данных.