Как производить Ubiquinone Coenzyme Q10 ферментацией?

Коэнзим Q10 (ubiquinOne-10, COenzyme Q10, Код 10), also known as ubiquinone (hereinafter referred to as Код 10). Its molecular formula is C59 H90 O4 and molecular weight is 863. The structural formula is as follows:

Ubiquinone Коэнзим Q10 is a fat-soluble quinone compound with orange-yellow crystals at room temperature and a melting point of 49 ℃, and it is odorless and tasteless [1].The physiological functions of Код 10 are mainly attributed to the redox properties of the quinone moiety and the physical properties of the isoprenoid side chain. Studies have shown that Код 10 in the reduced state and isoprene monomers with all trans structures have higher activity and pharmacological effects than Код 10 in the oxygenated state and isoprene monomers with all cis structures.

Роль Код 10 была впервые определена мур и др. в 1940 году, но не привлекла большого клинического внимания, а в 1957 году кран и др. очищен Код 10 от миокарда крупного вина и измерил его химическую структуру, подтвердив, что Код 10 на самом деле играет важную роль в качестве redox-перевозчика в дыхательной транспортной цепи млекопитающих.

Ubiquinone Coenzyme Q10 Известно, что является жирорастворимым электроносным носителем между надх дегидрогеназой, сукцинатом дегидрогеназы и комплексом су в дыхательной цепи, и это является клеточным энергогенерирующим элементом, поэтому это природный антиоксидант и активатор клеточного метаболизма, и это важно при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, и это может улучшить иммунитет человека и лечить заболевания иммунной системы человека. Как природный антиоксидант, он может быть использован в охране здоровья и красоты [2]. В китае из года в год растет использование капсул Код 10, однако сырье в основном зависит от импорта, что требует отечественного производства больших объемов недорогих сырьевых материалов и препаратов COQ10.

1 метод производства COQ10

COQ10 широко встречается в растительных и животных тканях, а также микробных организмах. Микроорганизмы, как правило, содержат высокие уровни COQ10, в то время как растительные и животные ткани содержат низкие уровни, что делает микроорганизмы хорошим источником COQ10.

Ubiquinone Coenzyme Q10 Могут быть подготовлены тремя методами: экстракция тканей животных и растений, микробная ферментация и химический синтез. В настоящее время в китае в основном используется экстракция тканей животных и растений. Зарубежные страны в основном используют микробную ферментацию, особенно в японии, где промышленное производство COQ10 путем микробной ферментации началось еще в 1977 году.

Метод химического синтеза характеризуется тяжелыми условиями и многими этапами; Кроме того, большинство изопреновых мономеров COQ10 являются структурами СНГ, которые не являются биологически активными, и содержание побочных продуктов является высоким, поэтому стоимость очистки высока. Метод экстракции тканей животных и растений в основном состоит из остатков свиного сердца после экстракции цитохрома с. Содержание COQ10 в тканях животных является низким, при урожайности всего 75 мг на кг свежего свиного сердца [3], а крупномасштабное производство ограничено ограниченностью сырья и источников.

В отличие от этого, производство Ubiquinone Coenzyme Q10 by microbial fermentation has several basic advantages: (1) я the fermentation product is natural, biologically active, and easily absorbed by the human body; (2) there is no limitation of raw materials, and the production capacity can be increased through scale-up. However, its limited content, low efficiency, and high production cost limit industrialization to a certain extent. If we can choose suitable strains for genetic modification, directional selection of strains with excellent performance, so as to increase the content of COQ10 in the bacterium, the production cost will be greatly reduced.

2 достижения в области микробной ферментации для производства кок10

2. Работа. 1 выбор штаммов

Несмотря на высокое содержание COQ10 в микробных организмах в природе, продукты ферментации представляют собой смесь различных конгенеров COQ10, что приводит к высокой стоимости очистки COQ10. Поэтому выбор штаммов для ферментации COQ10 имеет первостепенное значение. Микроорганизмы, используемые в ферментации COQ10, перечислены в таблице 1.

Таблица 1 содержание COQ10  Микроорганизмы [4]

Из приведенной выше таблицы видно, что содержание COQ10 в организме фотосинтезирующих бактерий (далее именуемых PSB) было в целом высоким. С точки зрения таксономического статуса PSB относится к phylum Bacteroidetes, который подразделяется на subphylum rhodobacterobacterotes и subphylum Green Thiobacteria, а первый подразделяется на семьи rhodoбактериологические и rhodoбактериологические; R. capsulatus и R. sphaeroides принадлежат к семейству rhodoбактериологических, что является одним из идеальных вариантов для штаммов, производящих кок10.

2. Работа. 2 генетическая модификация штаммов

Ubiquinone Coenzyme Q10 Производственные мощности штаммов дикого типа недостаточны для удовлетворения производственных потребностей и могут быть генетически модифицированы с использованием традиционных мутагенезов и методов генной инженерии. 

2. Работа. 2. Работа. 1 Размножение для метаболического регулирования COQ10

В 1976 году рудни предложил на международной конференции по COQ10, что путь микробного синтеза COQ10 в основном разделен на биосинтез пути ароматического синтеза кольца и изофрениловой боковой цепи. По биосинтезу пути ароматического кольца и изофрениловой боковой цепи в сочетании с механизмом метаболического регулирования бактерий, селекционный путь для размножения высокопродуктивных штаммов COQ10 в промышленной ферментации можно разделить на следующие:

(1) Отбор и размножение страдающих от недостатка питательных веществ штаммов мутантов

Олсон и руни [5] пришли к выводу, что как каротеноиды, так и кок10 анаболизированы полиизопином в качестве прекурсоров и что сокращение производства каротеноидов может способствовать биосинтезу кок10. Таким образом, выбор штамма PSB зеленого мутанта может увеличить содержание COQ10. Йошида и др. [6] мутагенизировали р. шпае-роиды ки -4113 и получили штамм зеленого мутанта с 10-20% увеличением содержания COQ10 по сравнению с диким штаммом.

(2) Отбор и размножение метаболических антагонистических штаммов мутантов

Удаление ингибиторов синтеза кок10 или связанного с ним анаболизма повысило уровень кок10. YOshida et al. [6] проверили штаммы мутантов на наличие прекурсоров, ингибиторов и их структурных аналогов (этилтионин, л-метионин, метилнафтохинон и даинорубицин) на синтез кок10 и получили ахробактериовые штаммы мутантов на 10-20% выше, чем дикие штаммы. Штамм мутантов ациенов был на 10-20% выше, чем дикий штамм.

Дополнительные комбинаторные штаммы мутантов, такие как непитательные штаммы мутантов и двойные штаммы мутантов, устойчивые к структурным аналогам, могут быть выбраны по нескольким маршрутам, чтобы значительно увеличить выход целевого продукта.

2. Работа. 2. Работа. 2 создание штаммов генной инженерии

Используя технологию молекулярной биологии, чтобы найти ключевой ген фермента COQ10 производственного штамма, и вводя этот ген в производственный штамм с помощью технологии рекомбинантной ДНК, с тем чтобы увеличить количество копировальных единиц ключевого гена фермента и выразить его эффективно, тем самым повышая способность синтезировать Ubiquinone Coenzyme Q10, это основной путь для построения штамма ферментации рекомбинанта COQ10.

Шагом, ограничивающим скорость в биосинтезе кокса у различных организмов, является конденсация гидроксибензоиновой кислоты с полиизопином, катализируемым ферментом парабен полиизопирен пирофосфотрансферазы. Исследования этого фермента показали, что он обладает относительно широкой субстратной спецификой [7]. На основе этого принципа, ген ubiA был клонирован из кишечной палочки и введен в PSB, и выражение этого гена было улучшено, чтобы получить высокую урожайность штамма COQ10.

С другой стороны, поскольку пб не является зрелым рецептором генной инженерии, поиск метаболического пути с использованием кишечной палочки в качестве рецептора был включен. Длина боковой цепи основных компонентов COQ контролируется генами (например, ispB E. coli, enzyme coq1, photosynthetic bacterium dds1 и т.д.), которые отличаются в различных клетках разных организмов из-за различных генов, контролирующих длину боковой цепи. E. coli легко культивируется при высокой плотности и имеет хорошо отлаженную систему выражения экзогенных генов, но основным компонентом COQ синтезируется E. coli является COQ8.

Поэтому можно клонировать ген, контролирующий длину боковой цепи COQ10 (dds1) от PSB и ввести его в клетки E. coli, и в то же время деактивировать ispB, ген управления боковой цепью COQ8, с тем чтобы реализовать крупномасштабное производство COQ10 в рекомбинатной E. coli. В настоящее время сёкухин и др. показали, что синтезировать COQ10 в кишечной палочке можно [8, 9].

2. Работа. 3 оптимизация условий ферментации

В дополнение к применению теории метаболического контроля для отбора и размножения высокоурожайных штаммов мутантов или построения рекомбинантных штаммов для повышения урожайности ферментации, оптимизация условий ферментации бактерий-производителей также является важным и эффективным способом повышения урожайности ферментации.

2. Работа. 3. Работа. 1 оптимизация средств массовой информации

В Ubiquinone Coenzyme Q10 Эксперименты по ферментации, оптимизации проводились путем отбора различных источников углерода, азота, факторов роста и неорганических солей для определения состава культурной среды. Показано, что ионы металлов, особенно Mg2+, Fe2+ и Mn2+, могут способствовать образованию COQ10 путем ферментации R. sphaeroides. Добавить еще 12. 2 ммоль/л мгсо4, 1. 8 mmOl/L FeSo4  ·7H2 o,0. 9 ммоль/л MnSo4 -7H2 o увеличили выход COQ10 с 2,0 мг/г сухого веса до 2,0 мг/г сухого веса 0 мг/г сухого веса до 8. 9 ~ 9. 6 мг/г сухого веса (Asahi Chemical Industry CO., Ltd., Ja- pan, 1981). Кроме того, прекурсоры могут значительно увеличить выход продукции и, при определенных условиях, контролировать поток анаболических продуктов в бактерии. К прекурсорам, которые, согласно сообщениям, добавляются в производство ферментации COQ10, относятся p- гидроксибензоиновая кислота, мевалоновая кислота, изопентенол и гераниол [10].

2. Работа. 3. Работа. 2 оптимизация культурных условий

(1) смешение-аэрации

Эффект возбуждения и аэрации на производство CoQ10 варьируется в зависимости от штамма, при этом Один стимулирует производство CoQ10 [11], а другой сдерживает его [4, 12]. Согласно существующим исследованиям, агитация и аэродирование неблагоприятно влияют на производство CoQ10 R. sphaeroides. Сакато и др. исследовали влияние агитации и аэрации на производство кок10 с использованием ферментации R. sphaeroides Ky8598 для производства кок10 [13]. Результаты показали, что лучший рост бактерий был достигнут тогда, когда потенциал redox (ORps) составлял - 150 мм, а самый высокий уровень производства CoQ10 был достигнут тогда, когда ORps был - 200 мм, т.е. ограничение подачи кислорода было благоприятным как для роста бактерий, так и для производства CoQ10.

На основе вышеуказанного исследования йошида и др. наблюдали влияние подачи кислорода на микроструктуру р. сфароидов электронной микроскопии [6]. Было показано, что внутренняя мембрана цитоплазмы бактерий, выращиваемых в условиях кислородной недостаточности, хорошо развита и имеет многослойную структуру, где расположен фотореакционный центр psB, что может привести к более высокому содержанию CoQ10, чем у бактерий, выращиваемых в условиях кислородной недостаточности.

(2) солнечный свет

Родобактерные сфероиды способны как специализироваться на анаэробных бактериальных фотосинтезах, так и аэробном дыхании и ферментации, а автомобиль и ExCell сообщили, что производство CoQ10 psB является высоким при анаэробных условиях света, но резко снижается, как только культура переключается на темные аэробные условия [4].

(3) время инкубации

Йошида и др. обнаружили, что содержание CoQ10 было выше, когда бактерии находились в достабилизационном периоде [6]. Чжу сюфэнь и др. также обнаружили, что содержание CoQ10 в бактериях увеличивалось с увеличением времени инкубации и достигло наивысшего уровня в середине периода достабилизации, а затем начало снижаться [14].

2. Работа. 4 CoQ10 извлечение из микробных клеток

Существует два способа извлечения CoQ10 из микробных клеток: несапонифицированный и сапонифицированный. Преимущество экстракции unsaponiable заключается в Том, что она не уничтожает CoQ10, хотя количество полученного экстракта меньше, чем количество полученного при сапонификации [15]. Сапонификация является классическим методом извлечения жирорастворимых веществ, который является простым, но дорогостоящим и ликвидируется в современном промышленном производстве [1, 16]. Недавно предложенный метод щелочной сапонификации может полностью исключить потребление пирогальевой галлиевой кислоты и этанола растворителя, а также использование кислотных дробильных элементов непосредственно сапонифицированных, с тем чтобы значительно снизить себестоимость CoQ10 и, таким образом, можно было бы применить к промышленному массовому производству.

3 перспективы на будущее

В настоящее времяprice of CoQ10 products on the market is high. Especially in China, most of CoQ10 products are imported, which is due to the low fermentation content of strains and the low yield of isolation and purification. Therefore, in order to realize the industrial production of CoQ10 by microbial fermentation, it is necessary to use conventional microbial breeding methods and recombinant DNA technology to genetically modify the production strains, increase the content of intracellular CoQ10, and optimize the extraction route to reduce the cost of extraction and isolation.

Ссылка:

[1] юннанский зоологический научно-исследовательский институт. Изоляция coenzyme Q10 от остатков свиного сердца для подготовки цитохрома C[J]. Фармацевтическая промышленность, 1976,(2):22.

[2] у зуфан и др. Прогресс в области функции коэнзима Q10. [J] журнал университета нинбо. 2001, 14(2):85-88.

[3] юань и. Экстракция и очистка coenzyme Q10 (CytC) из свиного сердца [J]. Журнал аньхуйского сельскохозяйственного университета, 1997, 24(2): 200 ~ 203.

[4] концентрации карр нг и Exell G. ubiQuiNoNe в росте атио-родового в различных экологических условиях [J].  Рост родовых культур в различных экологических условиях [J]. - биохим. J., 1965, 96: 688 ~ 692.

[5] OlsoN EO и RudNey H. BiosyNthesis of ubiQuiNoNe [J]. - витам. - привет. Вот это да. , 1983, 40: 1 ~ 43.

[6] Yoshida H et al. производство ubiQuiNoNe - 10 с использованием baC- terial [J]. Генерал джей аппл. - микробиол. , 1998, 44: 19 ~ 26.

[7] El HaChimi Z, Самуил о и др. Биохимическое исследование биосинтса бибихинона в кишечнике коли. 1. Специфика пара-гидрабензоат полипренылтрансферазы [J].  Биохим-то есть. , 56: 1239 ~ 1247.

[8] шокухин а. образование убихинона — 10. Jp11056372.

[9] чжу х, юаса м, окада к, сузуки к, накагава т. производство бихинона в EsCheriChia Coli путем выражения различных генов, ответственных за биосинкз бибихинона [J]. Биосинтез [J].J. В полном восторге. - биоэнг. , 1995, 79(5):493 ~ 95.

[10] Matsumura M, Kobayashi T, Aiba s. Анаэробное производство ubiQuiNoNe — 10 paraCoCCos deNitrifiCaNs [J].Eur. - джей апл. - микробиол. - биотехнол. 1983 год, 17(2):85 89.

[11] худац GR и трейфаил д-р эффкт анеробиоза о концентции деметилменакинона, менакинона и убихинона в эшерихии фрундии, протеус мирабилис и аэромонас пунктата [J]. - биохим. J., 1968, 108: 505 ~ 507.

[12] ураками т и йошида т. производство бихинона и бактериального хлорофилла а родобактерскими сфаериодами и родобактерными сульфидофилами [J]. - джей фермент. - биоэнг. , 1993, 76: 191 ~ 194.

[13] сакато к и др. Агитация-исследования аэрации при производстве коэнзима Q10 с использованием родопсодомонаса sphaeriodes [J]. - биотехнол. - привет. - привет. - биохим. 1992, 16: 19 ~ 28.

[14] чжу сюфен, цзэн юньчжун и др. Изучение видов ubiquinone и синтезирующих условий в организмах [J]. Журнал чжэцзянского университета (Science Edition), 2000, 27(3): 324 ~ 328.

[15] оян пинкай, ху ё н хон. Производство coenzyme Q10 и его применение [J]. Прогресс химической промышленности, 1994, 4: 9 ~ 11.

[16] Ikeda T, Matsumoto T et al. Образование кубихинона клетками табачных растений в культуре подвески [J]. PhytoChem-истри, 1976, 15: 568 ~ 569.