Как производить Ubiquinone Coenzyme Q10 ферментацией?

Coenzyme Q10 (ubiquinone -10, Coenzyme Q10, Код 10), также известный как ubiquinone (далее именуемый Код 10). Его молекулярная формула C59 H90 O4 и молекулярный вес 863. Структурная формула является следующей:

Ubiquinone Coenzyme Q10 Является жирорастворимым квинноном с оранжево-желтыми кристаллами при комнатной температуре и температуре плавления 49 градусов, без запаха и вкуса [1]. Физиологические функции Код 10 в основном связаны с редоксными свойствами благочестия хинона и физическими свойствами боковой цепи изопреноидов. Исследования показали, что коq10 в пониженном состоянии и изопреновый мономер со всеми трансструктурами имеют более высокую активность и фармакологические эффекты, чем коq10 в оксигеновом состоянии и изопреновый мономер со всеми структурами СНГ.

Роль Код 10 была впервые определена мур и др. в 1940 году, но не привлекла большого клинического внимания, а в 1957 году кран и др. очищен Код 10 от миокарда крупного вина и измерил его химическую структуру, подтвердив, что Код 10 на самом деле играет важную роль в качестве redox-перевозчика в дыхательной транспортной цепи млекопитающих.

Ubiquinone Coenzyme Q10 Известно, что является жирорастворимым электроносным носителем между надх дегидрогеназой, сукцинатом дегидрогеназы и комплексом су в дыхательной цепи, и это является клеточным энергогенерирующим элементом, поэтому это природный антиоксидант и активатор клеточного метаболизма, и это важно при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, и это может улучшить иммунитет человека и лечить заболевания иммунной системы человека. Как природный антиоксидант, он может быть использован в охране здоровья и красоты [2]. В китае из года в год растет использование капсул Код 10, однако сырье в основном зависит от импорта, что требует отечественного производства больших объемов недорогих сырьевых материалов и препаратов Код 10.

1 метод производства Код 10

COQ10 широко встречается в растительных и животных тканях, а также микробных организмах. Микроорганизмы, как правило, содержат высокие уровни COQ10, в то время как растительные и животные ткани содержат низкие уровни, что делает микроорганизмы хорошим источником COQ10.

Ubiquinone Coenzyme Q10 Могут быть подготовлены тремя методами: экстракция тканей животных и растений, микробная ферментация и химический синтез. В настоящее время в китае в основном используется экстракция тканей животных и растений. Зарубежные страны в основном используют микробную ферментацию, особенно в японии, где промышленное производство COQ10 путем микробной ферментации началось еще в 1977 году.

Метод химического синтеза характеризуется тяжелыми условиями и многими этапами; Кроме того, большинство изопреновых мономеров COQ10 являются структурами СНГ, которые не являются биологически активными, и содержание побочных продуктов является высоким, поэтому стоимость очистки высока. Метод экстракции тканей животных и растений в основном состоит из остатков свиного сердца после экстракции цитохрома с. Содержание COQ10 в тканях животных является низким, при урожайности всего 75 мг на кг свежего свиного сердца [3], а крупномасштабное производство ограничено ограниченностью сырья и источников.

В отличие от этого, производство Ubiquinone Coenzyme Q10 Микробная ферментация имеет несколько основных преимуществ: (1) я продукт ферментации является естественным, биологически активным и легко всасывается в организм человека; (2) нет никаких ограничений на сырье, и производственные мощности могут быть увеличены за счет наращивания. Однако ее ограниченное содержание, низкая эффективность и высокие производственные издержки в определенной степени ограничивают индустриализацию. Если мы сможем выбрать подходящие штаммы для генетической модификации, направленный отбор штаммов с отличной производительностью, с тем чтобы увеличить содержание COQ10 в бактерии, себестоимость производства будет значительно снижена.

2 достижения в области микробной ферментации для производства кок10

2. Работа. 1 выбор штаммов

Несмотря на высокое содержание COQ10 в микробных организмах в природе, продукты ферментации представляют собой смесь различных конгенеров COQ10, что приводит к высокой стоимости очистки COQ10. Поэтому выбор штаммов для ферментации COQ10 имеет первостепенное значение. Микроорганизмы, используемые в ферментации COQ10, перечислены в таблице 1.

Таблица 1 содержание COQ10  Микроорганизмы [4]

Из приведенной выше таблицы видно, что содержание COQ10 в организме фотосинтезирующих бактерий (далее именуемых PSB) было в целом высоким. С точки зрения таксономического статуса PSB относится к phylum Bacteroidetes, который подразделяется на subphylum rhodobacterobacterotes и subphylum Green Thiobacteria, а первый подразделяется на семьи rhodoбактериологические и rhodoбактериологические; R. capsulatus и R. sphaeroides принадлежат к семейству rhodoбактериологических, что является одним из идеальных вариантов для штаммов, производящих кок10.

2. Работа. 2 генетическая модификация штаммов

Ubiquinone Coenzyme Q10 Производственные мощности штаммов дикого типа недостаточны для удовлетворения производственных потребностей и могут быть генетически модифицированы с использованием традиционных мутагенезов и методов генной инженерии. 

2. Работа. 2. Работа. 1 Размножение для метаболического регулирования COQ10

В 1976 году рудни предложил на международной конференции по COQ10, что путь микробного синтеза COQ10 в основном разделен на биосинтез пути ароматического синтеза кольца и изофрениловой боковой цепи. По биосинтезу пути ароматического кольца и изофрениловой боковой цепи в сочетании с механизмом метаболического регулирования бактерий, селекционный путь для размножения высокопродуктивных штаммов COQ10 в промышленной ферментации можно разделить на следующие:

(1) Отбор и размножение страдающих от недостатка питательных веществ штаммов мутантов

Олсон и руни [5] пришли к выводу, что как каротеноиды, так и кок10 анаболизированы полиизопином в качестве прекурсоров и что сокращение производства каротеноидов может способствовать биосинтезу кок10. Таким образом, выбор штамма PSB зеленого мутанта может увеличить содержание COQ10. Йошида и др. [6] мутагенизировали р. шпае-роиды ки -4113 и получили штамм зеленого мутанта с 10-20% увеличением содержания COQ10 по сравнению с диким штаммом.

(2) Отбор и размножение метаболических антагонистических штаммов мутантов

Удаление ингибиторов синтеза кок10 или связанного с ним анаболизма повысило уровень кок10. YOshida et al. [6] проверили штаммы мутантов на наличие прекурсоров, ингибиторов и их структурных аналогов (этилтионин, л-метионин, метилнафтохинон и даинорубицин) на синтез кок10 и получили ахробактериовые штаммы мутантов на 10-20% выше, чем дикие штаммы. Штамм мутантов ациенов был на 10-20% выше, чем дикий штамм.

Дополнительные комбинаторные штаммы мутантов, такие как непитательные штаммы мутантов и двойные штаммы мутантов, устойчивые к структурным аналогам, могут быть выбраны по нескольким маршрутам, чтобы значительно увеличить выход целевого продукта.

2. Работа. 2. Работа. 2 создание штаммов генной инженерии

Используя технологию молекулярной биологии, чтобы найти ключевой ген фермента COQ10 производственного штамма, и вводя этот ген в производственный штамм с помощью технологии рекомбинантной ДНК, с тем чтобы увеличить количество копировальных единиц ключевого гена фермента и выразить его эффективно, тем самым повышая способность синтезировать Ubiquinone Coenzyme Q10, это основной путь для построения штамма ферментации рекомбинанта COQ10.

Шагом, ограничивающим скорость в биосинтезе кокса у различных организмов, является конденсация гидроксибензоиновой кислоты с полиизопином, катализируемым ферментом парабен полиизопирен пирофосфотрансферазы. Исследования этого фермента показали, что он обладает относительно широкой субстратной спецификой [7]. На основе этого принципа, ген ubiA был клонирован из кишечной палочки и введен в PSB, и выражение этого гена было улучшено, чтобы получить высокую урожайность штамма COQ10.

С другой стороны, поскольку пб не является зрелым рецептором генной инженерии, поиск метаболического пути с использованием кишечной палочки в качестве рецептора был включен. Длина боковой цепи основных компонентов COQ контролируется генами (например, ispB E. coli, enzyme coq1, photosynthetic bacterium dds1 и т.д.), которые отличаются в различных клетках разных организмов из-за различных генов, контролирующих длину боковой цепи. E. coli легко культивируется при высокой плотности и имеет хорошо отлаженную систему выражения экзогенных генов, но основным компонентом COQ синтезируется E. coli является COQ8.

Поэтому можно клонировать ген, контролирующий длину боковой цепи COQ10 (dds1) от PSB и ввести его в клетки E. coli, и в то же время деактивировать ispB, ген управления боковой цепью COQ8, с тем чтобы реализовать крупномасштабное производство COQ10 в рекомбинатной E. coli. В настоящее время сёкухин и др. показали, что синтезировать COQ10 в кишечной палочке можно [8, 9].

2. Работа. 3 оптимизация условий ферментации

В дополнение к применению теории метаболического контроля для отбора и размножения высокоурожайных штаммов мутантов или построения рекомбинантных штаммов для повышения урожайности ферментации, оптимизация условий ферментации бактерий-производителей также является важным и эффективным способом повышения урожайности ферментации.

2. Работа. 3. Работа. 1 оптимизация средств массовой информации

В Ubiquinone Coenzyme Q10 Эксперименты по ферментации, оптимизации проводились путем отбора различных источников углерода, азота, факторов роста и неорганических солей для определения состава культурной среды. Показано, что ионы металлов, особенно Mg2+, Fe2+ и Mn2+, могут способствовать образованию COQ10 путем ферментации R. sphaeroides. Добавить еще 12. 2 ммоль/л мгсо4, 1. 8 mmOl/L FeSo4  ·7H2 o,0. 9 ммоль/л MnSo4 -7H2 o увеличили выход COQ10 с 2,0 мг/г сухого веса до 2,0 мг/г сухого веса 0 мг/г сухого веса до 8. 9 ~ 9. 6 мг/г сухого веса (Asahi Chemical Industry CO., Ltd., Ja- pan, 1981). Кроме того, прекурсоры могут значительно увеличить выход продукции и, при определенных условиях, контролировать поток анаболических продуктов в бактерии. К прекурсорам, которые, согласно сообщениям, добавляются в производство ферментации COQ10, относятся p- гидроксибензоиновая кислота, мевалоновая кислота, изопентенол и гераниол [10].

2. Работа. 3. Работа. 2 оптимизация культурных условий

(1) смешение-аэрации

Эффект возбуждения и аэрации на производство CoQ10 варьируется в зависимости от штамма, при этом Один стимулирует производство CoQ10 [11], а другой сдерживает его [4, 12]. Согласно существующим исследованиям, агитация и аэродирование неблагоприятно влияют на производство CoQ10 R. sphaeroides. Сакато и др. исследовали влияние агитации и аэрации на производство кок10 с использованием ферментации R. sphaeroides Ky8598 для производства кок10 [13]. Результаты показали, что лучший рост бактерий был достигнут тогда, когда потенциал redox (ORps) составлял - 150 мм, а самый высокий уровень производства CoQ10 был достигнут тогда, когда ORps был - 200 мм, т.е. ограничение подачи кислорода было благоприятным как для роста бактерий, так и для производства CoQ10.

На основе вышеуказанного исследования йошида и др. наблюдали влияние подачи кислорода на микроструктуру р. сфароидов электронной микроскопии [6]. Было показано, что внутренняя мембрана цитоплазмы бактерий, выращиваемых в условиях кислородной недостаточности, хорошо развита и имеет многослойную структуру, где расположен фотореакционный центр psB, что может привести к более высокому содержанию CoQ10, чем у бактерий, выращиваемых в условиях кислородной недостаточности.

(2) солнечный свет

Родобактерные сфероиды способны как специализироваться на анаэробных бактериальных фотосинтезах, так и аэробном дыхании и ферментации, а автомобиль и ExCell сообщили, что производство CoQ10 psB является высоким при анаэробных условиях света, но резко снижается, как только культура переключается на темные аэробные условия [4].

(3) время инкубации

Йошида и др. обнаружили, что содержание CoQ10 было выше, когда бактерии находились в достабилизационном периоде [6]. Чжу сюфэнь и др. также обнаружили, что содержание CoQ10 в бактериях увеличивалось с увеличением времени инкубации и достигло наивысшего уровня в середине периода достабилизации, а затем начало снижаться [14].

2. Работа. 4 CoQ10 извлечение из микробных клеток

Существует два способа извлечения CoQ10 из микробных клеток: несапонифицированный и сапонифицированный. Преимущество экстракции unsaponiable заключается в Том, что она не уничтожает CoQ10, хотя количество полученного экстракта меньше, чем количество полученного при сапонификации [15]. Сапонификация является классическим методом извлечения жирорастворимых веществ, который является простым, но дорогостоящим и ликвидируется в современном промышленном производстве [1, 16]. Недавно предложенный метод щелочной сапонификации может полностью исключить потребление пирогальевой галлиевой кислоты и этанола растворителя, а также использование кислотных дробильных элементов непосредственно сапонифицированных, с тем чтобы значительно снизить себестоимость CoQ10 и, таким образом, можно было бы применить к промышленному массовому производству.

3 перспективы на будущее

В настоящее время цена на продукцию CoQ10 на рынке высока. Особенно в китае, большая часть продукции CoQ10 импортируется, что связано с низким содержанием ферментации штаммов и низкой урожайностью изоляции и очистки. Поэтому для реализации промышленного производства CoQ10 путем микробной ферментации необходимо использовать традиционные методы микробной селекции и рекомбинатную ДНК-технологию для генетической модификации производственных штаммов, увеличения содержания внутриклеточного CoQ10, оптимизации маршрута экстракции с целью снижения затрат на экстракцию и изоляцию.

Ссылка:

[1] юннанский зоологический научно-исследовательский институт. Изоляция coenzyme Q10 от остатков свиного сердца для подготовки цитохрома C[J]. Фармацевтическая промышленность, 1976,(2):22.

[2] у зуфан и др. Прогресс в области функции коэнзима Q10. [J] журнал университета нинбо. 2001, 14(2):85-88.

[3] юань и. Экстракция и очистка coenzyme Q10 (CytC) из свиного сердца [J]. Журнал аньхуйского сельскохозяйственного университета, 1997, 24(2): 200 ~ 203.

[4] концентрации карр нг и Exell G. ubiQuiNoNe в росте атио-родового в различных экологических условиях [J].  Рост родовых культур в различных экологических условиях [J]. - биохим. J., 1965, 96: 688 ~ 692.

[5] OlsoN EO и RudNey H. BiosyNthesis of ubiQuiNoNe [J]. - витам. - привет. Вот это да. , 1983, 40: 1 ~ 43.

[6] Yoshida H et al. производство ubiQuiNoNe - 10 с использованием baC- terial [J]. Генерал джей аппл. - микробиол. , 1998, 44: 19 ~ 26.

[7] El HaChimi Z, Самуил о и др. Биохимическое исследование биосинтса бибихинона в кишечнике коли. 1. Специфика пара-гидрабензоат полипренылтрансферазы [J].  Биохим-то есть. , 56: 1239 ~ 1247.

[8] шокухин а. образование убихинона — 10. Jp11056372.

[9] чжу х, юаса м, окада к, сузуки к, накагава т. производство бихинона в EsCheriChia Coli путем выражения различных генов, ответственных за биосинкз бибихинона [J]. Биосинтез [J].J. В полном восторге. - биоэнг. , 1995, 79(5):493 ~ 95.

[10] Matsumura M, Kobayashi T, Aiba s. Анаэробное производство ubiQuiNoNe — 10 paraCoCCos deNitrifiCaNs [J].Eur. - джей апл. - микробиол. - биотехнол. 1983 год, 17(2):85 89.

[11] худац GR и трейфаил д-р эффкт анеробиоза о концентции деметилменакинона, менакинона и убихинона в эшерихии фрундии, протеус мирабилис и аэромонас пунктата [J]. - биохим. J., 1968, 108: 505 ~ 507.

[12] ураками т и йошида т. производство бихинона и бактериального хлорофилла а родобактерскими сфаериодами и родобактерными сульфидофилами [J]. - джей фермент. - биоэнг. , 1993, 76: 191 ~ 194.

[13] сакато к и др. Агитация-исследования аэрации при производстве коэнзима Q10 с использованием родопсодомонаса sphaeriodes [J]. - биотехнол. - привет. - привет. - биохим. 1992, 16: 19 ~ 28.

[14] чжу сюфен, цзэн юньчжун и др. Изучение видов ubiquinone и синтезирующих условий в организмах [J]. Журнал чжэцзянского университета (Science Edition), 2000, 27(3): 324 ~ 328.

[15] оян пинкай, ху ё н хон. Производство coenzyme Q10 и его применение [J]. Прогресс химической промышленности, 1994, 4: 9 ~ 11.

[16] Ikeda T, Matsumoto T et al. Образование кубихинона клетками табачных растений в культуре подвески [J]. PhytoChem-истри, 1976, 15: 568 ~ 569.