Как получить природный ванилин из феруловой кислоты?

Аннотация: ванилин является третьим по величине пищевым специй в мире, и с улучшением людей ' с сознанием здоровья, дозировка природного ванилина растет из года в год. В этой статье стрептомицис псаммотикус омк -4 был использован в качестве бактерии ферментации для производства ванилина, а условия ферментации были определены и оптимизированы в 30- литровом автоматическом ферменторе пополнения. Оптимальные условия ферментации были определены путем оптимизации количества инокулята, температуры инкубации, pH инкубации, растворенного кислорода и других условий ферментации, а мощность достигал 25,3 г/л. Были получены следующие результаты.

Ваниллин, научно известный как 4- гидроксий -3- метоксибензальдегид, встречается в перуанских бальзамах, гвоздичное масло, ваниль, кофе, виноград и бренди, имеет ванильный запах и сладкий вкус [1-3]. Ваниллин является важным ароматом, который может быть использован как усилитель аромата, ароматизатор, гармонизатор, и ароматизатор усилитель в пищевой, табачной, косметической и сельскохозяйственной продукции.  Из-за широкого спектра применения годовой спрос на ванилин растет на 10%, но внутреннего производства все еще недостаточно для удовлетворения спроса на внутреннем и международном рынках [4-5].

Ванилин может быть получен химическим синтезом, экстракцией, биотваренцией и ферментативными методами [6]. С ростом числа людей#39; сознание здоровья, спрос и цена на природный ванилин постоянно растут, и это стало горячей темой исследований в последние годы [7]. Однако ограниченное количество природного ванилина, добываемого растениеводством, далеко не удовлетворяет рыночный спрос, а экологическое бремя, вызванное химическим синтезом, становится все тяжелей и тяжелей, поэтому основным фактором производства ванилина стали методы биопреобразования и фермента [8-9].

В настоящем документе принят метод биопреобразования вПроизводить ванилин через микробный метаболизмС феруловой кислотой в качестве субстрита, который имеет короткий цикл, высокую урожайность и меньше загрязнения, и после оптимизации условий ферментации, условия для индустриализации.

1 материалы и методы

1.1 испытательные штаммы

Стрептомицис псаммотикус омк -4 был сдан на хранение в штаммную комнату сямынь омикрон биотех ко.

1.2 основные приборы

30 L automatic reill fermenter, Shanghai Baoxing Biotechnology Co., Ltd; Высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC), Agilent, 1260 Ⅱ; Биосенсор, академия наук шаньдуна, SBA-40E; Спектрофотометр, шимадзу, уф -1780; PH метр, меттлер, S-210S.

1.3 средства массовой информации

1.3.1 семенная среда

Растворимый крахмал 1,0 ~ 3,5 г/л, фосфат калия диводород 0,1 ~ 0,5 г/л, мочета 0,1 ~ 0,3 г/л, сульфат магния 0,05 ~ 0,10 г/л, карбонат кальция 0,1 ~ 0,3 г/л, порошок выщелачивания дрожжей 0,1 ~ 1,0 г/л, кукурузный сироп 0,1 ~ 1,0 г/л, сульфат аммония 0,1 ~ 0,6 г/л, феруловая кислота 0,2 г/л.

1.3.2 ферментационные среды

Растворимый крахмаль 2,0 ~ 5,0 г/л, фосфат калия диводород 0,1 ~ 0,3 г/л, мочевина 0,1 ~ 0,5 г/л, сульфат магния 0,05 ~ 0,1 г/л, карбонат кальция 0,5 ~ 2,0 г/л, дрожжевой экстракт 0,1 ~ 1,0 г/л, сульфат аммония 0,1 ~ 0,5 г/л и кислота авик 2,0 г/л. Ниже приводятся некоторые примеры растворимого крахмала, использованного при подготовке образца.

1.4 методы выращивания

1.4.1 культура семян

В асептических условиях шпатель для прививки использовался для встраивания полного кольца хорошо выращенных штаммов из искусственной твердой смолы в стерильную семенную среду, начальный pH семенной среды составлял 5~8, а организмы культивировались до стадии логарифмического роста в условиях инкубационной температуры 28~35 гравитационной и вращательной скорости 200~500 об/мин.

1.4.2 культуры ферментера

Семенная жидкость, полученная на этапе логарифмического роста, была добавлена в ферментацию в асептических условиях при объеме 5%~15%; Первоначальный pH ферментационной среды составлял 7,2 ~ 7,8, ферментация производилась в течение 70~120 ч при температуре 30~40 ° с, скорости вращения 200~500 ° с/мин и скорости аэрации 1 ° с 0,5 ° с. Ферментация проводилась в условиях 1 градуса 0,5, ферментация-в условиях 1 градуса 0,5.

1.5 оптимизация условий ферментации

1.5.1 влияние pH на ферментацию ванилина

PH процесса ферментации влияет не только на существование субстрата, но и коррелирует с осмотическим давлением клеток, которое влияет на вход и выход субстрата в клетки и из них. Для получения оптимального показателя pH ферментации изучалось влияние различных методов регулирования pH на потенцию ваниллина, а также конкретные методы: (1) pH всего процесса ферментации контролировался на уровне 7,5; (2) pH процесса ферментации контролируется на уровне 7,5 в течение 0-12 часов, а затем pH последующего процесса ферментации контролируется на уровне 8,0;

(3) pH контролировался на уровне 8,0 на протяжении всего процесса ферментации.

1.5.2 воздействие растворенного кислорода наВаниллиновая ферментация

Эксперименты показали, что контроль растворенного кислорода в броте ферментации оказывает большое влияние на рост бактерий и накопление продуктов на более поздней стадии, поэтому необходимо контролировать растворенный кислород в процессе ферментации. В целях оптимального регулирования содержания растворенного кислорода в ферментации были изучены последствия различных мер регулирования содержания растворенного кислорода для роста бактерий и накопления продуктов. Были проведены следующие эксперименты: 0%, 10%, 20%, 30%, 40% и 50% растворенного кислорода контролировались с помощью скорости вращения и аэрации, соответственно.

1.5.3 влияние температуры инкубации на ферментацию ванилина

Температура оказывает важное воздействие на микробное производство, синтез и накопление метаболита. Повышенная температура может ускорить рост и обмен веществ микроорганизмов, но слишком высокая температура может также привести к преждевременному спаду организма и повлиять на накопление продуктов. Поэтому важно оптимизировать температуру штамма [10]. Для того, чтобы получить оптимальную температуру культуры ферментации, мы исследовали влияние различных температур культуры на рост бактерий, и сравнили рост бактерий и накопление ваниллина, контролируя температуры 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃ и 40 ℃, чтобы получить оптимальный метод регулирования температуры. 

1.5.4 воздействие инокулята на ферментацию ванилина

Различные количества инокулята оказывают важное влияние на нормальный рост и метаболизм бактерий, слишком мало инокулята приведет к замедлению роста бактерий, период задержки роста бактерий будет более продолжительным, а сложность вторичных метаболитов не способствует накоплению более поздних продуктов; Слишком много инокулята приведет к избыточному росту бактерий, а среда увеличит истощение питательных веществ, а растворенный кислород не сможет соответствовать требованиям контроля [11]. Поэтому важно контролировать количество инокулята ферментации. Для достижения оптимального уровня ферментации инокулята были исследованы последствия различных уровней инокулята на рост бактерий, а рост бактерий и накопление ваниллина были сопоставлены с пятью градиентами уровней инокулята 1%, 3%, 5%, 7% и 9%, с тем чтобы получить оптимальный уровень инокулята.

1.6 методы анализа

Определение концентрации бактерий: принять раствор культуры и разбавить его дистиллированной водой в течение определенного количества раз, затем хорошо смешать и измерять абсорбцию при 620нм с помощью спектрофотометра.

Определение остаточного содержания сахара: феррин' использовалась титрация реагента [12]. Определение содержания ванилина: HPLC [13].

2 результаты и обсуждение

2.1 влияние pH на ферментацию ванилина

Как показано на рис. 1, рост бактерий был лучше при pH 7,5, с максимальным OD620 0,62; Рост бактерий был хуже при pH 8,0, с максимальным OD620 0,41; И рост бактерий был лучше при pH 7,5 для 0-12 ч, с максимальным OD620 0,64 при последующем контроле 8,0. Таким образом, рост бактерий был облегчен pH 7,5, а рост бактерий был медленнее, когда pH был выше. Чем выше pH, тем медленнее рост бактерий. Из сегментированного контроля pH, можно видеть, что рост бактерий не было затронуто, когда pH был скорректирован до 8,0 на более поздней стадии, так что бактерии в основном достигли стадии стабилизации около 12 ч ферментации.

На рис.2 видно, что концентрация ваниллина составляла 13,200 г/л, 16,988 г/л и 14,500 г/л под различным контролем pH, а скорость преобразования ваниллина была самой высокой при pH 7,5 от 0 до 12 ч, а затем при pH 8,0, затем при pH 8,0, и была более низкой при pH 7,5, что может объясняться тем, что активность фермента была лучше, чем у pH 7,5 при pH 8,0. Это может быть связано с тем, что активность фермента при pH 8,0 была лучше, чем при pH 7,5.

Комбинируя рис. 1 и 2, можно сделать вывод о Том, что рост бактерий был лучше при pH 7,5, а скорость преобразования фермента была выше при pH 8,0. Поэтому было решено, что контроль сегментации во время ферментации поможет росту бактерий и получить лучшую ферментационную активность.

2.2 воздействие растворенного кислорода на ферментацию ванилина

Как видно из рис. 3, с увеличением содержания растворенного кислорода концентрация бактерий увеличивалась, при этом рост бактерий был наихудшим на уровне 0% растворенного кислорода, в основном без роста бактерий; При 40%~50% растворенного кислорода, это было оптимальное состояние роста для бактерий, и рост бактерий был самым высоким, и OD620 был 0,75. В случае увеличения растворенного кислорода, время для бактерий, чтобы войти в период логарифмического роста постепенно уменьшается, а когда растворенный кислород достигает 40%~50%, адаптивный период для роста бактерий является кратчайшим, и бактерии могут войти в период логарифмического роста быстро, тем самым сокращает цикл ферментации. Таким образом, можно судить, что рост бактерий требует большого количества кислорода, а рост бактерий лучше всего, когда уровень растворенного кислорода составляет 40%~50%.

На рис. 4 видно, что накопление ванилина постепенно увеличивалось, а затем медленно уменьшалось с увеличением содержания растворенного кислорода, и наилучшая концентрация ванилина была обнаружена на уровне около 30% растворенного кислорода, а самая высокая концентрация составила около 17,5 г/л. Низкий уровень накопления ваниллина при низком содержании растворенного кислорода может быть обусловлен плохим производством бактерий, недостаточным содержанием фермента или низким уровнем содержания растворенного кислорода, влияющим на жизнеспособность фермента. С постепенным увеличением содержания растворенного кислорода накопление ваниллина постепенно демонстрировалось понижательной тенденцией, особенно при 50% растворенного кислорода, уменьшение концентрации ваниллина происходило на поздних стадиях ферментации, и было установлено, что накопление ваниллиновой кислоты в качестве побочного продукта постепенно увеличивалось, что, как предполагается, было вызвано избыточной концентрацией растворенного кислорода, что привело к смещению потока метаболизма в сторону производства ванильной кислоты. Предполагается, что уровень растворенного кислорода является слишком высоким, что приводит к смещению метаболического потока в сторону производства ванилина. Поэтому уровень растворенного кислорода на стадии производства ванилина не должен быть слишком высоким, чтобы не влиять на общий коэффициент преобразования.

Как видно из рис. 3 и 4, контроль растворенного кислорода в процессе ферментации был выбран для контроля поэтапно, в ходе которого растворенный кислород контролировался на уровне 40%~50% на стадии бактериального роста для обеспечения накопления объема бактерий и сокращения цикла роста бактерий, а растворенный кислород контролировался на уровне 30% на стадии производства ванилина для обеспечения быстрого накопления продукта.

2.3 влияние температуры инкубации на ферментацию ванилина

На рис. 5 видно, что рост бактерий был медленным, когда температура была низкой, а концентрация бактерий была выше и выше с увеличением инкубационной температуры, и концентрация бактерий была самой высокой, когда температура достигла около 35 градусов, и OD620 достигла 0,73; Однако концентрация бактерий начала снижаться с увеличением температуры до 40 градусов, что, вероятно, из-за разрушения нормального метаболизма бактерий высокой температурой.

Как видно из рис. 6, при постепенном повышении температуры, скорость преобразования ваниллина была выше и выше, а эффект преобразования составлял 35 градиентов, 30 градиентов, 40 градиентов и 25 градиентов в порядке величины; Согласно расчетам скорости преобразования каждой бактерии, оптимальные температуры были 40 градусов, 35 градусов, 30 градусов и 25 градусов в порядке величины. Оптимальная температура была 40 градусов, 35 градусов, 30 градусов и 25 градусов. Можно видеть, что скорость преобразования ванилина была выше и выше с постепенным повышением температуры, а скорость преобразования ванилина при более высоких температурах была лучше, чем у ванилина при более низких температурах.

Сравнивая диаграммы 5 и 6, можно увидеть, что влияние температуры на ферментацию и преобразование ванилина штамма омк -4 было больше, и температура 35 градуса была выбрана для культуры штамма и преобразования ванилина.

2.4 влияние инокулята на ферментацию ванилина

На рис.7 мы видим влияние различных количеств инокулята на конечную концентрацию бактерий, пять различных количеств инокулята могут достичь концентрации около 0,7, из которых 1% инокулята имеет наихудший эффект, самая высокая концентрация составляет только около 0,65.  В первые 10 ч, с увеличением количества штамма, период задержки ферментации был явно сокращен, по сравнению с 1% и 9%, период задержки был явно сокращен примерно на 6 ч. Из рис. 8 видно, что 9% инокулята было более эффективным, чем 1% инокулята. На рис. 8 видно, что инокулят в размере 9% был явно хуже, чем другие четыре инокулята количества, вероятно, из-за того, что бактерии поставлялись в основном в процессе выращивания и фермент жизнеспособность будет уменьшаться с увеличением концентрации бактерий. Поэтому количество инокулята не должно быть слишком большим в процессе прививки. Если сравнить количество инокулята в 1%, 3%, 5% и 7%, то коэффициент преобразования ваниллина был несколько выше, чем четыре других количества инокулята, и наибольшее количество преобразования составило 17,21 г/л, 17,23 г/л, 18,05 г/л и 17,27 г/л. Учитывая результаты по инжиру 7 и 8, было окончательно выбрано оптимальное количество инокулята 5%.

3. Выводы

Оптимальные условия ферментации, полученные в результате оптимизации 30л автозарядного ферментера: pH 7,5 и растворенный кислород 40%~50% от 0 до 12 ч, а затем pH 8,0 и растворенный кислород 30%; Температура ферментации во время ферментации составляла 35 градусов, а количество инокулята - 5%. Температура ферментации 35 градусов, а количество инокулята 5%. Ферментация производилась в оптимальных условиях для 36 ч, а конечная мощность ванилина достигал 25,3 г/л, что явилось хорошим результатом пилотного эксперимента.

Справочные материалы:

[1] у шийи, ли айцзюнь, бао хуйян и др. Прогресс биологического производства ванилина [J]. Наука и техника пищевой промышленности гуанчжоу,2000,20(2):119-121.

[2] сюйчжу ван. Безопасная, здоровая, вкусная, лучше делать ванильные продукты и решения -- интервью с лю яном, генеральным менеджером азиатско-тихоокеанского региона, и хуан хабо, директором отдела глобальной стратегии и маркетинга, Solvay Flavors and Performance Chemicals Division [J]. Журнал пищевой безопасности,2019,238(13):28-30.

[3] янь венвен. "Прогресс биосинтеза природного ванилина, королевы специй [J]. Microbiology Bulletin,2013,40(6):1087 — 1095.

[4] вентилятор Y. ход исследования микробного преобразования феруловой кислоты в субstrate для производства ванилина [J]. Зерновая и пищевая промышленность,2017,24(6):43 — 47.

[5] сюй конгву. Контрмеры по повышению прибыльности экспорта ванилина в китае [J]. Журнал колледжа чифэн,2014(2):82-84.

[6] чжен да, у сяоган, Дэн бэй и др. Применение микробного синтеза ванилина [J]. Исследования и разработки в области продовольствия,2012(3):144 — 149.

[7] Lv Xiaojie. Состояние развития ванильной промышленности [J]. Современные продукты питания,2019,7(5):14-16.

[8] чжан цзяньбинь. Прогресс в исследованиях и перспективы технологии подготовки ванилина [J]. Химическая промышленность провинции гуандун,2018(12):163 — 166.

[9] хорват м, фьюме г, фриче с и др. Открытие редуктазы карбоксиловой кислоты (вагон) из термотеломициса термофилы и ее оценка на синтез ванилина [J]. Журнал биотехнологии,2019,8(7):44-51.

[10] Nida K, Aamer A S, Sadia Q. оптимизация pH и температуры для разложения каучука шины штаммом S10 Bacillus sp., изолированным от осадка сточных вод [J] Дата биоразложения,2015,5(9):154 — 160.

[11] ван хопенг, ян Мэн, у лимин и др. Оптимизация условий ферментации и экспериментальное испытание цистерны fumonisin 5L [J]. Китай пивоварение,2019,38(2):98-103.

[12] чжан шэньчжэнь, ма янжи. Сравнение методов определения общего содержания сахара в яблоках [J]. Цзянсу сельскохозяйственная наука 2009(2):259-260.

[13] хуан юхуан, лю хунчжоу, ю рюйхен. Определение ванилина высокопроизводительной жидкостной хроматографией [J]. Субтропические науки о растениях,1998,27(2):17-20.