Исследование по лекарственному растению Лу хан го

Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jef-frey ex Lu et Z. Y. Zhang is the dried fruit of a dioecious, dioecious perennial vine in the family Cucurbitaceae. It is cool in nature, sweet in taste, and enters the lung meridian. It has the effects of clearing away heat from the lungs, moistening the lungs, relieving sore throat and improving voice, and lubricating the intestines to promote bowel movement. It is used to treat cough due to lung heat, sore throat with loss of voice, and constipation due to dryness in the intestines [1]. As a precious medicinal and sweetening plant unique to China, Luo Han Guo is mainly produced in Yongfu, Lingui and Longsheng, etc., in Guangxi. The fruit of Luo Han Guo contains a variety of sweet glycosides, among which Могросайд V is one of the strongest non-sugar sweeteners in the world, about 300 times sweeter than sucrose. It is widely used in foods, health products and medicines, and is an ideal sugar substitute for diabetics, obese people and hypertensive patients [2]. This paper reviews the taxonomic status, geographical distribution, main cultivated varieties, breeding and cultivation techniques, chemical composition, pharmacological effects and molecular biology research of Luo Han Guo, with a view to providing a reference for further in-depth research, development and utilization of Luo Han Guo.

1 таксономический статус сирайтии гросвенори

Что касается таксономии сирайтии гросвенори, то меррилл впервые создал новый род (сирайтия) в 1934 году с с. silomaradjae в качестве вида, но он не был признан. В 1941 году американский Swingle классифицировал Luo Han Guo как вид рода Momordica в семье Cucurbitaceae после его идентификации на основе образца тан юнхуа No. 1 (собранного в округе юнфу, гуанси). В 1979 году, изучив этот образец, британский ботаник Джеффри пришел к выводу, что ло хан го не относится к роду момордика, а к роду тладианта, основываясь на Том, что сухожилия растения бифферката на оконечности и скручивается вверх и вниз в точке бифферкации, он полагал, что плоды луохана принадлежат не роду момордика, а роду тладианта, и назвал его тладианта grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey. В этом отношении многие ученые в китае скептически настроены [3]. В 1997 году чжуанг вейцзянь и др. [4] наконец установили, что число хромосомы Лу хан го равно x = 14, в то время как у рода Tribulus-x = 9, а у рода Momordica-x = 11 или 14. Кроме того, морфология пыльцы Luo Han Guo значительно отличается от той, что у Tribulus terrestris, и более похожа на ту, что у Momordica charantia и Tribulus terrestris, за исключением размера пыльцы и размера сетки [5].

В 1980 году, во время джефрей'. Во время посещения китая для изучения образцов Лу анмин и др. из института ботаники китайской академии наук [6] пришли к выводу о Том, что мужские антеровые локулы лоханской фруктовой группы были инлексированы или вырезаны, а семена были значительно больше, что явно отличалось от рода момордика. Они также пришли к выводу о Том, что он не может быть помещен в род момордика, поскольку эти растения не имеют bracts на женских и мужских цветочных стеблях, стамены не три, а пять, и фруктовая кожа гладкая и без клубневых выступов. Поэтому было предложено выделить сирайтию и создать новый род. Впоследствии Джеффри использовал название рода сирайтия, предложенное меррилом в его статье «восточноазиатская Cucurbitaceae», и перенял все виды сирайтии в род сирайтия. В настоящее время ботаническая таксономия, как правило, принимает таксономические притязания Джеффри и Лу анмин и др. [6] в 1984 году, что научное название сирайтия гросвенория (Swingle) с. Джеффри ex Lu et Z. Y. Zhang является сирайтия гросвенория (Swingle) с. Джеффри ex Lu et Z. Y. Zhang, и что это растение в роду сирайтия в семье Cucurbitaceae. Однако в ранней литературе сирайтия гросвенория до сих пор иногда пишется как тлади-анта или момордика гросвенория.

2. Распространение Siraitia grosvenorii

Ресурсы сирайтии grosvenorii в основном распределены в некоторых горных районах гуанси, гуандун, хунань, гуйчжоу, хайнань и цзянси провинции (регионы) в китае. Эти районы характеризуются влажным тропическим и субтропическим климатом, высотой 250-1400 м, обжигом 106,5 ° с - 115,0 ° с и северной широтой 21,0 ° с - 24,5 ° с.  Однако его распределение не является равномерным. Среди них уезды юнфу и лингви в гуанси являются центрами культивирования Лу хан го [7]. Лу хан го широко распространен в гуанси, из округа чжапин в городе хечжоу на востоке, пубэй в городе циньчжоу на юге, линьюн в городе байзе на западе, и лингуи в городе гуйлинь на севере. Среди них наиболее компактное распространение имеет гора даяо в автономном округе цзиньсиу-яо [8].

3 основных сорта луоханго

Основными культивируемыми сортами луоханго являются цинпиго, дунгуанго, ладжианго, чантан го, хонмаого и чашанго. Из-за серьезного вреда, причиняемого вирусными болезнями, нематодическими заболеваниями рутколов, бактериальными вялыми и фруктовыми мухами и т.д., а также использования культуры ткани для распространения семян может достичь цели быстрого распространения и очистки хороших сортов, поэтому в последние годы в районах производства ло хан го широко пропагандируется культура тканей таких сортов, как болин и цингпи. Среди них, болин No. 3 является новым штаммом ло хан го, который был успешно выбран из болин No. 2 зеленый плоды. После apical shoot дезинфекции и быстрого распространения, направленного культивирования и очистки и омоложения, он был успешно культивирован в 2003 году.

It has excellent characteristics such as wide adaptability, well-developed roots, vigorous growth, drought and fertilizer tolerance, concentrated flowering, early fruiting and high yield, low pest and disease damage, few physiological fruit cracks, high rate of medium and large fruits, good quality, and stable seed characteristics [9]. Yongqing No. 1 is a female clonal variety that was produced by crossing a winter melon fruit as the male parent with a Longjiang green-skinned fruit as the female parent, followed by two years of single plant selection and tissue culture breeding. The fruits of this variety are long and oval, with a large fruit rate of up to 73.48% with an average single fruit weight of 100 g. The content of sweetener V, total fruit glycoside, total sugar, water extract and vitamin C is as high as 1.03%, 8.84%, 17.40%, 37.90% and 3.02 mg/g, respectively. It has good yield and strong stress resistance, with up to

165 000 с гектара [10].

4 методы пропаганды и выращивания для луоханго

Основными традиционными методами распространения луоханьго являются распространение семян, распространение клубней, расслоение, распространение вырубки и распространение пересадки. С учетом нынешнего серьезного положения, связанного с вирусными заболеваниями, нематодическими заболеваниями корней и нашествию фруктовых мух в районах производства, а также неблагоприятных последствий традиционных методов посадки, таких, как обезлесение горных лесов в ущерб окружающей среде, что ведет к эрозии почвы, деградации среды обитания и т.д., с одной стороны, традиционные методы распространения претерпели изменения, И значительный прогресс достигнут в экспериментальных исследованиях с использованием тканевой культуры для получения безвирусных саженцев [11, 12]. Среди них, гуанси медицинский ботанический сад, гуанси институт ботаники, и гилин High-tech Zone Berlin Biotechnology Co., Ltd., занимаются отбором, разведением и быстрым распространением превосходных штаммы Luohanguo в последние годы, что в определенной степени улучшило устойчивость к стрессу Luohanguo и достигло цели увеличения производства и повышения качества. В настоящее время в районах производства широко пропагандируются саженцы культур тканей таких сортов, как цингпи и болин; С другой стороны, было много дискуссий и попыток преобразовать традиционный метод посадки холмов луоханго в метод возделывания плоскостных земель [13].

5 химический состав луоханго

5.1 кукурбитановые тритерпеноиды и их гликозиды

At present, the main triterpenoid and its glycosides isolated and identified from the fruit of Luohanguo are: Simonoside I, Mogroside II E, Mogroside III, Mogroside III E, Mogroside IV, Mogroside V, 11-oxo-Mogroside V [14], Mogroside ⅣA and Mogroside ⅡA1 [15], Luohanguo digolyl benzoate [16], and Luohanguo neoglycoside [17]. The above components are the main sweet components of Luohanguo, accounting for 3.755% to 3.858% of the dried fruit content. Among them, Mogroside V is the main sweetening component, while Simonoside I is the sweetest component of the cucurbitane triterpene glycosides. When its content is 0.01%, the sweetness of the two is 256 to 344 times and 563 times that of a 5% sucrose aqueous solution, respectively. In addition, Luo Han Guo acid A and Luo Han Guo acid B [18] and Luo Han Guo acid E [19] have been isolated and identified from the root of Luo Han Guo.

5.2 белки и аминокислоты

Xu Weikun et al. [20] обнаружили, что содержание белка в сушеных фруктах Luo Han Guo составляло от 7,1% до 7,8%. В гидролисате, за исключением триптофана, который не был обнаружен, присутствуют все 18 аминокислот, в Том числе 8 необходимых аминокислот для организма человека. Наиболее высоким содержанием является глютамическая кислота и апартическая кислота, что свидетельствует о Том, что Лу хан го имеет определенную питательную ценность.

5.3 флавоноиды

Si Jianyong et al. [21] isolated two flavonoid glycoside components from fresh Luo Han Guo aqueous extract: kaempferol-3,7-α-L-dirhamnoside and kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside-7-O-[β-D-glucopyranosyl-(1-2)-O-L-rhamnoside]. Chen Quanbin et al. [22] isolated and identified kaempferol-3,7-O-α-L-dirhamnoside and quercetin-3-O-β-D-glucose-7-O-α-L-rhamnoside from the leaves of Luo Han Guo, with kaempferol and quercetin as the aglycones. Liao Riquan et al. [23] isolated and identified luohangol benzoate, bis[5-formylfurfuryl] ether, 5-hydroxymethyl furfuroic acid, succinic acid, magnolol, kaempferol, kaempferol-3,7-0-a-L-dirhamnoside, of which bis[5-formylfurfuryl] ether, 5-hydroxymethyl furfural and magnolol were isolated from Luo Han Guo for the first time.

5.4 прочие ингредиенты

The fresh fruit of Luo Han Guo contains Д-маннитол[24]; Спелые плоды содержат 26 неорганических элементов (16 из которых имеют существенное значение для организма человека) [25] и большое количество глюкозы и фруктозы [26]; Семенное масло богато ненасыщенными жирными кислотами [27].

6 фармакологические эффекты Лу хан го

6.1 эффекты ожидания и подавления кашля

Luo Han Guo Mogroside V can increase the secretion of phenol red in the trachea of mice, promote the movement of mucus in the esophagus of frogs, and inhibit ammonia-induced coughing in mice. However, it has no significant effect on guinea pig asthma induced by citric acid, indicating that Luo Han Guo sweet glycosides have expectorant and antitussive effects [28].

6.2 антибактериальный эффект

Су уаньцюнь и др. [29] нашли это турбидиметриейЭкстракт Лу хан гоcan significantly limit the growth and acid production ability of Streptococcus mutans, thereby inhibiting its cariogenic effect. The inhibition rates of the ethanol extract of the leaves and stems of Luo Han Guo (50.0 mg/mL) on Pseudomonas aeruginosa were 90.9% and 76.7%, respectively. In addition, the inhibition rate of the above stem extract on Escherichia coli was also as high as 70.2% [30].

6.3 иммунная функция

Сладостный гликозид Лу хан го не оказывает существенного влияния на иммунную функцию нормальных мышей, но может значительно улучшить фагоцитическую функцию макрофагов и пролиферативный эффект клеток т у иммуноподавимых мышей циклофосфамиды (CTX) [31]. Экстракт воды Лу хан го может усилить юморальные и клеточные иммунные функции обычных крыс и улучшить неспецифическую иммунную функцию мышей [29].

6.4 противотанковый эффект

Тесты In vitro на мышах с экстрактом Luo Han Guo показали, что антиканцерологический эффект Luo Han Guo sweetin V сопоставим или сильнее, чем эффект stevioside [32].

6.5 антиоксидантный эффект

Monk fruit extract can effectively remove free radicals, inhibit the oxidation and hemolysis of red blood cells, and the production of malondialdehyde (MDA), indicating that it has antioxidant activity, and monk fruit glycosides are the main antioxidant active ingredients [33].

7 молекулярные биологические исследования на фруктах монахов

Ранние исследования молекулярной биологии в ло хан го были ограничены исследованиями с использованием молекулярных маркеров, таких как RFLP [34], RAPD [35-37], ISSR [38], AFLP [39] и SRAP [40], которые использовались для изучения генетического разнообразия, родства, половой идентификации, генетического фона, отпечатков пальцев и генетических карт ло хан го. Некоторые исследователи использовали технологию секвенирования второго поколения с высокой производительностью Solexa для выполнения высокопроизводительного секвенирования транскриптома плодов Luohanguo и профилей выражения 3 d, 50 d и 70 d после опыления, получая 43 891 унифицированный образец, из которых 739 были связаны с вторичным метаболизмом Luohanguo, 60 унифицированных образцов, участвовавших в синтезе костей terpene. На основе транскриптомных данных были обнаружены все гены в биосинтетических путях Luo Han Guo sweet glycoside V, включая 20 синтетических генов Luo Han Guo glycoside и 2 типа генов структурной модификации (цитохром P450 генов и гликозилтрансферазы). Кроме того, было получено 80 генов P450, 72 генов гликозилтрансферазы и 90 генов глюкозилтрансферазы. В сочетании с просмотром профиля экспрессии было получено 6 возможных генов upg, которые могут быть связаны с синтезом логанина V. С помощью технологии RACE были клонированы 16 генов синтеза скелетов и 2 генов с 5 'или 3' фрагментами, а также 6 генов CYP450 и 7 генов glucosyltransferase. Расшифровка профиля транскриптомы и экспрессии закладывает прочную основу для функционального генома ло хан го и исследования молекулярного механизма биосинтеза подсластителя V.

Перспективы на 8 лет

Являясь важным лекарственным и пищевым растительным ресурсом, Лу хан го является хорошо известной специальностью и традиционным экспортным товаром в китае с давней репутацией внутри страны и за рубежом. Однако вирусные заболевания, нематодные узлы и фруктовые мухи всегда ограничивали здоровое развитие отрасли Лу хан го. Поэтому необходимо применять комплексные методы контроля с упором на сельское хозяйство и биологический контроль для сведения к минимуму и строгого контроля за использованием химических агентов во избежание загрязнения пестицидами посевной среды, растений, фруктов; В то же время следует прилагать усилия для выведения сортов Luohanguo, устойчивых к болезням и насекомым.

В луоханго действуют строгие требования в отношении посевной среды, узкой посевной площади и посадочного барьера. Постоянно возделываемые культуры крайне уязвимы перед вредителями и болезнями, и изменение посевных площадей ежегодно требует больших людских, материальных и финансовых ресурсов. Кроме того, в нынешних производственных районах по-прежнему используются главным образом традиционные методы посадки, которые часто предполагают вырубку горных лесов, что приводит к негативным последствиям, таким, как эрозия почвы и ухудшение среды обитания, а также к другим негативным последствиям. По этой причине автор считает, что необходимо активизировать исследования почвенных микроорганизмов на посевных площадях, с тем чтобы как можно скорее преодолеть препятствия, связанные с непрерывным возделыванием ло хан го.

Luo Han Guo is a unisexual, dioecious plant. The pollen of male flowers is heavy and sticky, and has a bitter taste. Relying solely on wind or insects to spread pollen will not result in a high rate of fertilization. Only artificial pollination can ensure production, and pollination is the process that requires the most labor. In recent years, a method that is easier and more effective than pollination with a bamboo skewer has been developed in production practice: Press the male flower petals to the fruit stalk to expose the stamens, and lightly touch the side with dense pollen to the female stigma. Investigations have found that the same species of plant, the winged Luohanguo, is highly resistant, has large fruits, and a high yield, making it a good material for breeding. Moreover, individual plants have bisexual flowers that bear fruit without human intervention, which is an atavistic phenomenon that provides insight into the evolution of angiosperms. Further research is needed on the winged Luohanguo, which has bisexual flowers, in order to solve the problem of Luohanguo's зависимость от вмешательства человека для опыления.

Из-за разрушения посевной среды зародышевая плазма в луоханго серьезно ухудшилась, и необходимо внедрять инновации в области зародышевой плазмы в луоханго.

Применение полиплоидной селекционной технологии в исследованиях и разработках новых сортов луоханго является эффективным способом преодоления дефектов оригинальных сортов. Поскольку моносакшарид существует только в мякоти и кожуре плода, а семена не содержат моносакшарида, но содержат большое количество семенного масла, что значительно увеличивает сложность извлечения, очистки и себестоимость производства, поэтому разведение бессемянного луоханго с более высоким содержанием моносакшарида, чем традиционные сорта, и высокий коэффициент использования всего плода является важной вехой на пути развития всей отрасли луоханго.

Справочные материалы:

[1] национальная фармакопеевая комиссия народа#39; китайская республика. Фармакопея людей и#39; китайская республика (часть I) [м]. Пекин: China Medical Science and Technology Press, 2010. 197.

[2] Li Dianpeng, Zhang hurui. Исследования и применение Лу хан го, специализированный завод в гуанси [J]. Гуанси ботаника, 2000, 20(3): 270-276.

[3] Li Jianqiang, Wu Zhengyi, Lu Anmin. Цитологическое наблюдение растений в подсемействе Cucurbitales [J]. Юньнань ботанические исследования, 1993, 15(1): 101 — 104.

[4] чжуан вэйцзянь, линь чжилян, чжэн шенькунь. Изучение хромосомного типа Лу хан го [J]. Журнал тропической и субтропической ботаники, 1997, 5(2): 23-25.

[5] цзоу цили. Наблюдение за пыльцей четырех растений: Лу хан го, му байзи, ку гуа и хэнань чи чин ин [J]. Гуанси ботаника, 1981, 1(3): 24-28.

[6] Лу анмин, чжан чжиюн. Китайские растения Luohanguo [J]. Гуанси ботаника, 1984, 4(1): 27-33.

[7] чжоу лянцай, чжан бию, цинь лян и др. Обследование и использование сортов и ресурсов луоханго [J]. Гуанси ботаника, 1981, 1(3): 29-33.

[8] чжун шицян. Статус исследования Лу хан го [J]. Гуанси сельскохозяйственная наука, 1992(4): 164-166.

[9] He Jinwang, Qin Zhengwei, Li Bolin. Технология высокоурожайной обработки нового штамма Лу хан го «болин No. 3» [J]. Guangxi Agricultural Journal, 2007, 22(1): 46-47, 62.

[10] ма сяоцзюнь, мо чанмин, бай лонхуа и др. Новый сорт Luo Han Guo, Yongqing No. 1 [J]. Журнал садоводства, 2008, 35(12): 1855.

[11] Li Feng, Jiang Hanming, Jiang Xinneng, et al. Исследование по выращиванию саженцев культуры тканей луоханго [J]. Гуанси ботаника, 1990, 10(4): 359-363.

[12] фу чанлян, ма сяоцзюнь, бай лонхуа и др. Исследование о быстром распространении безвирусных саженцев Luohanguo [J]. Китайская травяная медицина, 2005, 36(8): 1225-1229.

[13] чжу баомин. Обсуждение технологии выращивания сирайтии гросвенории на равнинах [J]. Гуанси садоводство, 2004, 15(3): 13-14.

[14] мацумото к, касаи р, отани к и др. Незначительные огурбитановые гликозиды от плодов сирайтии гросвенории (Cucur-bitaceae) [J]. Хем фарм булл, 1990, 38(7): 2030 — 2032.

[15] ян сювэй, чжан цзянь, цянь чжун мин. Новые естественные сапонины из сирайтии гросвенории [J]. Китайская травяная медицина, 2008, 39(6): 810-814.

[16] ван япин, чэнь цзяню. Исследование химических составляющих сирайтии гросвенории [J]. Китайская травяная медицина, 1992, 23(2): 61.

[17] СИ цзяньонг, чэнь дихуа, чан ци и др. Изоляция и структурная идентификация тритерпеноидов гликозидов в ло хан го [J]. Acta Botanica Sinica, 1996, 38(6): 489-494.

[18] ван сюэфен, Лу вэньцзе, чэнь цзяюань и др. Исследование химических компонентов корня ло хан го (I) [J]. Китайская травяная медицина, 1996, 27 (9): 515-518.

[19] СИ цзяньонг, чэнь дихуа, шэнь ляньган и др. Исследование химических составляющих корень ло хан го, специализированный завод в гуанси [J]. Журнал фармацевтических наук, 1999, 34 (12): 918-920.

[20] сюй вейкун, Мэн лишань. Определение содержания белка в ло хан го [J]. Гуанси растения, 1986, 6(3): 295-296.

[21] СИ цзяньонг, чэнь дихуа, чан ци и др. Изоляция и структурное определение флавоноидных гликозидов в свежем Лу хан го [J]. Журнал фармацевтических наук, 1994, 29(2): 158-160.

[22] чэнь кванбин, ян цзяньсян, чэн чжун цюань и др. Отделение и структурная идентификация флавоноидных гликозидов из ло хан го (сирайтия гросвенория) [J]. Наука гуанси, 2006, 13(1): 35 — 36, 42.

[23] ляо рикуан, ли цзюнь, хуан сишань и др. Исследование химического состава ло хан го [J]. Acta Botanica boreale-occidentalia Sinica, 2008, 28(6): 1250-1254.

[24] сюй вэйкун, Мэн лишань, ли чжуняо. Отделение и идентификация маннитола в ло хан го [J]. Гуанси растения, 1990, 10(3): 254-255.

[25] Мэн сялинь, чжоу ци, ронг сяойи и др. Определение и анализ неорганических элементов в ло хан го и их корни [J]. Традиционная китайская медицина гуанси, 1989, 12(6): 42.

[26] сюй вейкун, Мэн лишань. Определение питательных компонентов Лу хан го [J]. Гуанси растения, 1981, 1(2): 50-51.

[27] чэн джуинг, Лу силиан, Пан юфа и др. Исследование масел гуанси растений: I. состав масла семян 50 видов растений [J]. Гуанси растения, 1980(2): 26-33.

[28] ван тин, хуан чжихун, цзян имин и др. Исследование биологической активности гликозидов из фруктов-монахов [J]. Китайская травяная медицина, 1999, 30 (13): 914-916.

[29] су уаньцюнь, чэнь зайи. Фармакологические и прикладные исследования на Лу хан го [J]. Традиционная китайская медицина, 2003, 26(10): 771-772.

[30] е мин, чжоу ин. Бактериальный эффект экстракта этанола листьев и стеблей ло хан го [J]. Журнал биологии горного сельского хозяйства, 2008, 27(1): 42 — 46.

[31] Wang Q, Wang C, Dai S и др. Регулятивный эффект Luo Han Guo sweet saponin на клеточную иммунную функцию мышей [J]. Традиционная китайская медицина, 2001, 24(11): 811-812.

[32] киджима т. антиканцеровый эффект сладкого вещества в ло хан го [J]. Иностранная медицина: дополнение к традиционной китайской медицине, 2003, 25(3): 174.

[33] чжан лицинь, ци сян ян, чэнь вэйцзюнь и др. Исследование антиоксидантной активности экстракта Лу хан го [J]. Наука о еде, 2006, 27(1): 213 — 216.

[34] вей ронгчанг, ли фэн, хуан сян и др. Оптимизация и применение ПCR -RFLP параметров для полиплоидов Luohanguo [J]. Гуанси ботаника, 2009, 29(6): 889-893.

[35] чжоу цзюня, тан шаоцин. RAPD анализ генетического разнообразия в культивируемых луоханго [J]. Молекулярная селекция растений, 2006, 4(1): 71-78.

[36] Huang Jiang, Jiang Huiping, Chen Tingsu и др. RAPD анализ генетических отношений различных зародышевых пластов Лу хан го [J]. Фуцзянское фруктовое дерево, 2006(1): 15-17.

[37] вей сулин, хуан зимей, ян хуа и др. Клон и анализ последовательности гендерных маркеров изнасилования в Лу хан го [J]. Хубэй сельскохозяйственная наука, 2008, 47(3): 251 — 253.

[38] вэй рончхан, ли хон, цзян цзяньган и др. Исср анализ генетического фона безсаженцев Лу хан го и их родителей [J]. Журнал садоводческой науки, 2012, 39 (2): 387 — 394.

[39] Tao Li, Wang Yuejin, You Min, et al. AFLP используется для создания ДНК отпечатка карты сирайтии гросвенории и определения Пола ее саженцев [J]. Вуханские ботанические исследования, 2005, 23 (1): 77-80.

[40] LIU L H, MA X J, WEI J H и др. Первая карта генетических связей луоханго (Siraitia grosvenorii) на основе маркеров ISSR и SRAP [J]. Геном, 2011, 54(1): 19-25.